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固定細胞イメージングへの5ステップ
科学的発見への道のりは、発見そのものと同様に重要です。当社は、成功を加速できる適切な道をお客様が選択するための支援に専念しています。
当社は40年にわたって細胞イメージング研究に従事しており、お客様が最高品質の細胞画像を取得できるよう、信頼性の高いツールおよびプロトコルを提供しています。実際に、Invitrogenイメージング試薬および抗体は、発表された研究で他の製品よりも頻繁に引用されています。
お客様が細胞イメージングの初心者でも、ご自身の知識を再確認したい熟練の研究者でも、固定細胞画像を最初から出版可能なものにするために、実績のある以下の5つのステップをご検討ください。
当社の経験を活用して頂くことで、コストのかかる間違った方向に進まないよう、お客様の成功を実現します。当社がお手伝いします。
固定細胞イメージング用製品選択ガイド
EVOS DAPI Light Cube（AMEP4650）
励起波長：357／44 nm；
発光：447／60 nm
| ステップ | アプリケーション | DAPIチャンネル用のキーツール |
|---|---|---|
| ステップ1.固定、透過処理、ブロッキング | バッファー |
|
| ステップ2.標識 | ||
| 細胞骨格 | ||
| 細胞膜 | ||
| 核 | ||
| ステップ3.検出 | 抗体直接標識キット | |
| Zenonキット | ||
| ストレプトアビジン | ||
| ステップ4.保護と増強 | シグナルエンハンサー | |
| 封入剤および退色防止試剤 | ||
| ステップ5.イメージング | イメージングと解析 |
EVOS GFP Light Cube (AMEP4651)
励起波長：470／22 nm；
発光：510／42 nm
| ステップ | アプリケーション | GFPチャンネル用のキーツール |
|---|---|---|
| ステップ1.固定、透過処理、ブロッキング | バッファー |
|
| ステップ2.標識 | ミトコンドリア | |
| 細胞骨格 | ||
| 細胞膜 | ||
| 核 | ||
| ステップ3.検出 | 抗体直接標識キット | |
| Zenonキット | ||
| 二次抗体 | ||
| ストレプトアビジン | ||
| SuperBoost TSAキット | ||
| ステップ4.保護と増強 | シグナルエンハンサー | |
| 封入剤および退色防止試剤 | ||
| ステップ5.イメージング | イメージングと解析 |
EVOS RFP Light Cube (AMEP4652)
励起波長：531／40 nm；
発光：593／40 nm
| ステップ | アプリケーション | RFPチャンネル用のキーツール |
|---|---|---|
| ステップ1.固定、透過処理、ブロッキング | バッファー |
|
| ステップ2.標識 | ミトコンドリア | |
| 細胞骨格 | ||
| 細胞膜 | ||
| 核 | ||
| ステップ3.検出 | 抗体直接標識キット | |
| Zenonキット | ||
| ストレプトアビジン | ||
| 二次抗体 | ||
| SuperBoost TSAキット | ||
| ステップ4.保護と増強 | シグナルエンハンサー | |
| 封入剤および退色防止試剤 | ||
| ステップ5.イメージング | イメージングと解析 |
EVOS Red Light Cube (AMEP4655)
励起波長：585／29 nm；
発光：624／40 nm
| ステップ | アプリケーション | Texas Redチャンネル用のキーツール |
|---|---|---|
| ステップ1.固定、透過処理、ブロッキング | バッファー |
|
| ステップ2.標識 | ||
| 細胞骨格 | ||
| 細胞膜 | ||
| ステップ3.検出 | 抗体直接標識キット | |
| Zenonキット | ||
| ストレプトアビジン | ||
| 二次抗体 | ||
| SuperBoost TSAキット | ||
| ステップ4.保護と増強 | シグナルエンハンサー | |
| 封入剤および退色防止試剤 | ||
| ステップ5.イメージング | イメージングと解析 |
EVOS Cy5 Light Cube (AMEP4656)
励起波長：628／40 nm；
発光：693／40 nm
| ステップ | アプリケーション | Cy5チャンネル用のキーツール |
|---|---|---|
| ステップ1.固定、透過処理、ブロッキング | バッファー |
|
| ステップ2.標識 | ミトコンドリア | |
| 細胞骨格 | ||
| 細胞膜 | ||
| 核 | ||
| ステップ3.検出 | 抗体直接標識キット | |
| Zenonキット | ||
| ストレプトアビジン | ||
| SuperBoost TSAキット | ||
| ステップ4.保護と増強 | シグナルエンハンサー | |
| 封入剤および退色防止試剤 | ||
| ステップ5.イメージング | イメージングと解析 |
EVOS DAPI Light Cube（AMEP4650）
励起波長：357／44 nm；
発光：447／60 nm
| ステップ | アプリケーション | DAPIチャンネル用のキーツール |
|---|---|---|
| ステップ1.固定、透過処理、ブロッキング | バッファー |
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| ステップ2.標識 | ||
| 細胞骨格 | ||
| 細胞膜 | ||
| 核 | ||
| ステップ3.検出 | 抗体直接標識キット | |
| Zenonキット | ||
| ストレプトアビジン | ||
| ステップ4.保護と増強 | シグナルエンハンサー | |
| 封入剤および退色防止試剤 | ||
| ステップ5.イメージング | イメージングと解析 |
EVOS GFP Light Cube (AMEP4651)
励起波長：470／22 nm；
発光：510／42 nm
| ステップ | アプリケーション | GFPチャンネル用のキーツール |
|---|---|---|
| ステップ1.固定、透過処理、ブロッキング | バッファー |
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| ステップ2.標識 | ミトコンドリア | |
| 細胞骨格 | ||
| 細胞膜 | ||
| 核 | ||
| ステップ3.検出 | 抗体直接標識キット | |
| Zenonキット | ||
| 二次抗体 | ||
| ストレプトアビジン | ||
| SuperBoost TSAキット | ||
| ステップ4.保護と増強 | シグナルエンハンサー | |
| 封入剤および退色防止試剤 | ||
| ステップ5.イメージング | イメージングと解析 |
EVOS RFP Light Cube (AMEP4652)
励起波長：531／40 nm；
発光：593／40 nm
| ステップ | アプリケーション | RFPチャンネル用のキーツール |
|---|---|---|
| ステップ1.固定、透過処理、ブロッキング | バッファー |
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| ステップ2.標識 | ミトコンドリア | |
| 細胞骨格 | ||
| 細胞膜 | ||
| 核 | ||
| ステップ3.検出 | 抗体直接標識キット | |
| Zenonキット | ||
| ストレプトアビジン | ||
| 二次抗体 | ||
| SuperBoost TSAキット | ||
| ステップ4.保護と増強 | シグナルエンハンサー | |
| 封入剤および退色防止試剤 | ||
| ステップ5.イメージング | イメージングと解析 |
EVOS Red Light Cube (AMEP4655)
励起波長：585／29 nm；
発光：624／40 nm
| ステップ | アプリケーション | Texas Redチャンネル用のキーツール |
|---|---|---|
| ステップ1.固定、透過処理、ブロッキング | バッファー |
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| ステップ2.標識 | ||
| 細胞骨格 | ||
| 細胞膜 | ||
| ステップ3.検出 | 抗体直接標識キット | |
| Zenonキット | ||
| ストレプトアビジン | ||
| 二次抗体 | ||
| SuperBoost TSAキット | ||
| ステップ4.保護と増強 | シグナルエンハンサー | |
| 封入剤および退色防止試剤 | ||
| ステップ5.イメージング | イメージングと解析 |
EVOS Cy5 Light Cube (AMEP4656)
励起波長：628／40 nm；
発光：693／40 nm
| ステップ | アプリケーション | Cy5チャンネル用のキーツール |
|---|---|---|
| ステップ1.固定、透過処理、ブロッキング | バッファー |
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| ステップ2.標識 | ミトコンドリア | |
| 細胞骨格 | ||
| 細胞膜 | ||
| 核 | ||
| ステップ3.検出 | 抗体直接標識キット | |
| Zenonキット | ||
| ストレプトアビジン | ||
| SuperBoost TSAキット | ||
| ステップ4.保護と増強 | シグナルエンハンサー | |
| 封入剤および退色防止試剤 | ||
| ステップ5.イメージング | イメージングと解析 |
できる限り高品質の固定細胞画像をキャプチャーするには、次の5ステップを踏んでください
ステップ1.調製
蛍光標識用に細胞を調製
最適な品質の画像を取得するには、まず目的のタンパク質と細胞構造に焦点を当て、他のことはすべて除外して研究を計画します。細胞サンプルを標識するために固定および透過処理を行います—最初に細胞構造、タンパク質、および核酸を固定し、次に抗体および蛍光色素が細胞内部に浸透できるようにして目的のターゲットを標識します。
固定することで、細胞構造が定位置に保持されます。
透過処理により、細胞膜脂質が除去され、標識化や検出試薬の細胞内部への到達が可能になります。
タンパク質ベースのブロッキング剤は非特異的染色の低減に役立ちます。抗体はブロッキング剤のタンパク質を置換してターゲットと親和性の高い相互作用を形成する一方、それ以外のブロッキング剤のタンパク質はサンプルの他の部分での親和性の低い抗体相互作用を防ぎます。
固定および透過処理の後、U2OS細胞をNucBlue Live Cell StainおよびActinGreen 488 ReadyProbes Reagentで染色しました。処理Aはメタノールベースの溶液で固定し、処理Bはホルムアルデヒドベースの Image-iT Fixation/Permeabilization Kitで固定しました。Aのメタノールベースの固定は、アクチン細胞骨格の断片化と細胞の破壊につながります。Image-iT Fixation/Permeabilization Kitは、ほとんどの細胞タイプに対して最適な固定状態を実現します。
1.1 培養条件–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
良い画像を得るための最初のステップは組織の調製です。培養細胞の場合、細胞の状態と形態が良好で、細胞密度が最適である必要があります。健全な細胞イコール健全なデータです。
良い画像を得るための最初のステップは組織の調製です。培養細胞の場合、細胞の状態と形態が良好で、細胞密度が最適である必要があります。健全な細胞イコール健全なデータです。
1.2 固定–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
組織の調製後に行うステップは固定です。固定とは、多くの場合形態を保持するために、特定の生理的状態で細胞を致死させて保存する化学的方法です。適切な固定は、ターゲットの保存に匹敵します。
1.3 透過処理–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
次のステップは細胞の透過処理で、これは細胞内分画を開くための鍵です。
1.4 ブロッキング–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
透過処理の次のステップはブロッキングで、ブロッキング技術は多数存在します。タンパク質のブロッキングは、特異的な抗体結合に相当します。電荷色素のブロッキングはより少ない非特異結合を意味します。
1.5 自家蛍光–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
細胞調製の最後のステップは自家蛍光です。細胞および組織はある程度自家蛍光し、これは特異的シグナルを混乱させ、シグナル／バックグラウンド比を低下させる可能性があります。自家蛍光の克服はより高い感度を意味します。
ステップ2.標識
細胞小器官（オルガネラ）選択的な色素、染色液、および一次抗体により、目的の細胞構造およびタンパク質をターゲット
さまざまなターゲットを別々の蛍光色で標識することにより、同一サンプル中の細胞内の異なる構造またはタンパク質を可視化することが可能です。ターゲットを標識する方法には、蛍光色素、免疫標識、および蛍光融合タンパク質が含まれます。これらはすべて、細胞内の構造および分子を選択的に標識する方法を提供し、イメージングの際にそれらの可視化を容易にします。
細胞生物学用の多くの蛍光ツールは基本的には、さまざまな方法で修飾されたり、さまざまな分子とコンジュゲートされた蛍光色素であり、特定の機能の付加、または特定のオルガネラまたはタンパク質との結合を可能にします。化学修飾により、1つの蛍光色素を、それぞれ異なる特異性を持つさまざまなフォームで作成できます。たとえば、緑蛍光のInvitrogen Alexa Fluor 488色素分子は、アクチンフィラメントをターゲットとするように修飾したり、当社の標識キット用いて免疫標識に使用するためにIgGに結合させたり、または全細胞の染色液として機能します。
主な製品
Invitrogenポートフォリオは、85%を超えるプロテオームへの特異性を有する、51,000を超える高品質な一次抗体を提供します。これらの抗体の一部は、Invitrogen Alexa Fluor色素などの幅広い高蛍光強度マーカーおよび標識に直接結合します。
単一の蛍光色素は任意の数の標識付けが可能で、機能化フォームに修飾することにより、アクチン（A）やチューブリン（B）などの細胞構造成分の標識や、塩フォームに修飾して細胞全体の染色（C）を行うことが可能です。
培養細胞をInvitrogen Image-iT Fixation/Permeabilization Kitを使用して染色用に調製し、Invitrogen BlockAid Blocking Solutionで処理しました。ミトコンドリアを認識する一次抗体でサンプルを標識し、続いてAlexa Fluor 750 Dye–conjugated Secondary Antibody（紫）、Invitrogen NucBlue Cell Stain （青）、およびInvitrogen ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent（緑）で標識しました。画像はInvitrogen EVOS FL Auto Imaging Systemで取得しました。
2.1 一次抗体の選択–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
出版品質の画像を得るために、調製後に行う第2ステップはサンプルの標識で、通常、目的の特定ターゲットに対する一次抗体が関与します。
2.2 一次抗体プロトコルの最適化–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
一次抗体は個別に最適化する必要があります。利用できるプロトコルは多数ありますが、すべての抗体はわずかに異なるため、「一つですべてに対応」というアプローチは好ましくない結果を生じることを理解することが重要です。
ステップ3.検出
蛍光シグナルを解析用に微調整
複雑な生物学的構造の検出は、蛍光シグナルの最大限の鮮明さと、バックグラウンドノイズからのシグナルの分離を必要とします。標準的な免疫蛍光標識で最良のS／Nを実現することはほとんどありません。出版品質の画像を得るには、ピークの特異性、解像度、および増幅度など、サンプルのしぐなるを微調整する必要があります。
Image-iT Fixation/Permeabilization Kitを使用して固定および透過処理したHeLa細胞を、抗チューブリン一次抗体およびAlexa Fluor 488 goat anti–mouse IgG (H+L) Secondary Antibodyとともにインキュベーションしました。次に細胞をAnti–ATP Synthase Subunit IF1 Antibodyとともにインキュベーションし、Alexa Fluor 594 Tyramide SuperBoost Kit（ヤギ抗マウスIgGおよびAlexa Fluor 594 Tyramide）に含まれる試薬で標識しました。核をNucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagentで標識しました。画像は共焦点顕微鏡で撮影しました。
高～中存在量タンパク質ターゲット
二次抗体はターゲットの間接検出に使用されます。一次抗体はターゲットに直接結合しますが、二次抗体は一次抗体を架橋として用いることで、ターゲットの生体分子と間接的に結合します。複数の二次抗体分子が1つの一次抗体分子に結合できるため、この方法はシグナルの増幅と感度の向上に寄与し、検出を最大限まで可能にします。
二次抗体を探す
二次検出では、一次抗体（橙色および黄色）はそれぞれ対応するエピトープに結合し、蛍光色素で標識された二次抗体（紫色および青色）はそれぞれの一次抗体に対する特異性を有し、結合します。
中～低存在量タンパク質ターゲット
ストレプトアビジンコンジュゲートは、ターゲットを標識する蛍光色素の数を増加させ、そのシグナルを増幅します。ストレプトアビジンベースの増幅手法は、一次および二次抗体による検出の感度向上のために蛍光イメージングで広く使用されています。
イメージングのためのストレプトアビジンシグナル増幅の詳細を見る
蛍光色素–ストレプトアビジンコンジュゲートを使用して標識された抗体は、標識実験において弱いシグナルを増幅できます。これは、より多くの蛍光色素が各抗体分子に結合でき、シグナルを増幅するためです。
低存在量タンパク質ターゲット
従来の方法では検出できない低存在量のタンパク質ターゲットに対しては、チラミドシグナル増幅（TSA、PerkinElmer）が、解像度を損なうことなく感度の高い検出を提供します。TSA技術には、過酸化水素の存在下で反応性色素を放出する酵素を使用しており、解像度および鮮明さによりターゲットからバックグラウンドを排除します。
TSAによる低存在量ターゲットのイメージングの詳細を見る
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チラミドシグナル増幅では、エピトープの周囲に高密度な蛍光標識が局所的に堆積することで高感度検出が可能になり、解像度を損なうことなく感度が向上します。
主な製品
Alexa Fluor Plus二次抗体は特許取得済みのPlus色素化学を使用しており、当社のAlexa Fluor組成と比較して4.2倍のS／N比を実現しているため、低存在量のターゲットを検出できる高い感度を提供します。
Invitrogen Tyramide SuperBoost KitはInvitrogen SuperBoost技術を使用しており、低存在量のタンパク質ターゲットに対する最高レベルの感度の蛍光イメージング検出法を提供します。SuperBoostキットは、標準的な免疫化学（ICC）、免疫組織化学（IHC）、およびin situハイブリダイゼーション（ISH）手法の10～200倍の感度を実現し、高解像度イメージングに必要な優れたシグナル増幅、解像度、および鮮明さを提供するようデザインされています。SuperBoost試薬はAlexa Fluor色素の高輝度性能を、実績のあるポリHRP介在チラミドシグナル増幅と組み合わせており、他のサプライヤーの試薬を含む標準的な処理方法の2～10倍の感度を実現しています。
3.1 二次抗体の選択–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
出版品質の画像を取得する5ステップの3つ目は標識の検出です。これは、たとえば二次抗体で検出することや増幅手法、また、どのコントロールを使用するかを決定することです。その選択肢について説明します。
3.2 二次抗体の最適化–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
二次抗体検出プロトコルも、使用する一次抗体別に最適化する必要があります。
3.3 増幅手法–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
標準的な二次抗体による検出でシグナル強度が十分でない場合、増幅手法を用いてシグナルを増強できます。これは、発現量の低い抗原、またはサンプル中の希少細胞の検出に特に重要です。
3.4 コントロール–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
非特異的結合や非特異的シグナルの可能性をなくすために、必要なすべてのコントロールをおく必要があります。コントロールのタイプについて説明します。適切なコントロールは、最終結果への自信を高めます。
3.5 色素の選択と特別な検討事項–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
可視光線、遠赤線、赤外線の波長を有する色素を各種取り揃えています。実験に適した色素を選択するうえで考慮事項を説明します。
ステップ4.保護
蛍光シグナルを光退色から保護し高解像度で画像品質を向上
蛍光色素は高品質の細胞イメージングを得るために最適ですが、光退色、すなわち蛍光シグナルの光化学的分解または減退がどうしても生じやすくなります。感光性が少しでも減少すると、データにゆがみが生じ、誤った結果が生じる可能性があります。退色防止マウント剤は、蛍光色素の光安定性を保護し、画像の完全性を数週間から数ヶ月にわたり維持するようデザインされています。
主な製品
Invitrogen ProLong Glass antifade mountantsは、可視および近赤外スペクトル領域全体にわたり卓越した退色防止効果を提供するようデザインされています。ProLong Glassマウント剤は1.52の屈折率を有し、多数の蛍光色素と併用して、0.1 µm～150 µmの事実上あらゆる細胞または組織サンプルに使用でき、高輝度かつ高解像度のZスタック、3D、および2D画像を実現します。画像のひずみがより小さいため、油浸レンズおよび共焦点顕微鏡で特に有効です。
固定細胞用ProLong antifade mountantsの主な利点：
- 長期保存後でも、広いスペクトル領域で光退色を抑制
- スペクトル全域で低バックグラウンド
- 硬化マウント剤
- DAPI含有または不含タイプをご用意
- ベンチトップですぐに使用できる剤形
- 必要に応じて屈折率を選択：ProLong Glass試薬では1.52、ProLong DiamondおよびProLong Gold試薬では1.47
ProLong antifade mountantsによって可能な光退色耐性の向上を示す60秒間の経時的変化。固定HeLa細胞をfluorescein phalloidinで標識し、ProLong Glass reagent、ProLong Diamond reagent、ProLong Gold reagent、または50% PBS／グリセロールで封入しました。画像は、一般的な100ワット水銀アーク灯からの連続照射と20倍対物レンズを使用し、12秒間隔で取得しました。
4.1 マウント剤–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
適切な封入剤を使用すると、実験に効果が波及する可能性があります。お客様の条件に合った適切なタイプのマウント剤を確実に選択してください。
4.2 光退色と退色防止剤–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
光退色の定義、光退色によるサンプル棄損の防止法退色防止剤の選択肢について説明します。
ステップ5.イメージング
最大限の鮮明さと解像度でイメージングの発見を保存
このステップを最適化して、研究上の発見を最大限の鮮明さと解像度で保存できます。今日の競合的な科学環境において、出版品質の画像作成は成功に不可欠です。最高品質の画像を取得するには、次のような最上級のイメージング要素を備えたイメージングプラットフォームが必要です。
- 高画質なイメージデータを保存できる高解像度カメラと光学系部品
- 優れたS／N比を実現するLED光源システム
- わずかな操作で画像を保存し、画像処理や解析ができるソフトウエア
- 広範囲の定量および統計解析を可能にする画像解析性能
主な製品
実験のニーズに合わせて調整できる、使いやすいモジュール式のシステムを選択してください。さまざまなLEDライトキューブ、ベッセルホルダー、および対物レンズでカスタマイズ可能なイメージングシステムを提供しています。選択できるInvitrogen EVOS LEDライトキューブは13を超え、幅広い蛍光励起および発光をカバーしています。
サンプルのスループットを増やして、より多くの定量データを取得する必要がありますか？CellInsight CX5 High Content Analysisプラットフォームは、自動画像キャプチャ機能と同時データ解析機能を提供し、最大50万個の表現型細胞測定を5分以内で解析することが可能になります。
以下でイメージングシステムを比較し、最適な機器を見つけてください。
当社の顕微鏡細胞イメージングシステムの全ラインアップに関する詳細情報を見る
蛍光の迅速視覚化に最適
| ベーシックな透過光デジタル倒立システム | 高度な透過光デジタル倒立システム | ベーシックな蛍光システム | 高度な蛍光システム | 完全 自動蛍光システム |
|---|---|---|---|---|
 EVOS XL Core 細胞培養およびルーチンの細胞維持に最適 |  EVOS XL（販売終了） 高度 比色解析アッセイに最適 |  EVOS FLoid 蛍光の迅速視覚化に最適 |
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当社のハイコンテントアナリシス細胞イメージングシステムの全ラインアップに関する詳細情報を見る
| 5チャンネルLEDシステム | 7チャンネルLED共焦点システム | 7チャンネルレーザー共焦点システム |
|---|---|---|
 CellInsight CX5 規模拡大のための小型でお手頃価格のシステムを求めている研究室に最適 試薬を見る |  CellInsight CX7 LED Pro より多くのイメージングモードの選択肢を求めている研究室に最適 試薬を見る |  CellInsight CX7 LZR Pro 感度とスピードのより高度な性能を求めている研究室に最適 試薬を見る |
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蛍光の迅速視覚化に最適
| ベーシックな透過光デジタル倒立システム | 高度な透過光デジタル倒立システム | ベーシックな蛍光システム | 高度な蛍光システム | 完全 自動蛍光システム |
|---|---|---|---|---|
EVOS XL Core 細胞培養およびルーチンの細胞維持に最適 | EVOS XL（販売終了） 高度 比色解析アッセイに最適 | EVOS FLoid 蛍光の迅速視覚化に最適 |
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5.1 イメージングプラットフォーム-ハードウェア–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
プロセスの5番目のステップは実際のイメージングです。最高品質の画像を取得するには、最上級のイメージング性能を備えたイメージングプラットフォームが必要です。ここでは、最高の画像を得るための検討事項について確認します。
5.2イメージングプラットフォーム-ソフトウエア–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
顕微鏡での画像撮影には通常、画像の撮影を補助し、さまざまな色を組み合わせて1つにするサポートをするイメージングソフトウエアが必要です。出版品質の画像を得るためには、留意すべき非常に重要な点がいくつかあります。
5.3 EVOS FL Auto 2.0による画像取得–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
ここでは、画像取得にEVOS FL Auto 2.0イメージングシステムを使用することの利点を説明します。
5.4 Cellesteソフトウエアでの画像解析–固定細胞イメージング：公表に耐え得る品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
Cellesteソフトウエアの機能を解説し、さまざまなソフトウエアプログラムで画像を処理する際の考慮事項を説明します。
5.5 倫理上の検討事項–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
倫理的なイメージングとは、信頼に足るデータ、すなわち論文掲載品質のデータを作成することを意味します。データの完全性を維持するためのサンプルおよびデータの取り扱い方を示します。
ステップ1.調製
蛍光標識用に細胞を調製
最適な品質の画像を取得するには、まず目的のタンパク質と細胞構造に焦点を当て、他のことはすべて除外して研究を計画します。細胞サンプルを標識するために固定および透過処理を行います—最初に細胞構造、タンパク質、および核酸を固定し、次に抗体および蛍光色素が細胞内部に浸透できるようにして目的のターゲットを標識します。
固定することで、細胞構造が定位置に保持されます。
透過処理により、細胞膜脂質が除去され、標識化や検出試薬の細胞内部への到達が可能になります。
タンパク質ベースのブロッキング剤は非特異的染色の低減に役立ちます。抗体はブロッキング剤のタンパク質を置換してターゲットと親和性の高い相互作用を形成する一方、それ以外のブロッキング剤のタンパク質はサンプルの他の部分での親和性の低い抗体相互作用を防ぎます。
固定および透過処理の後、U2OS細胞をNucBlue Live Cell StainおよびActinGreen 488 ReadyProbes Reagentで染色しました。処理Aはメタノールベースの溶液で固定し、処理Bはホルムアルデヒドベースの Image-iT Fixation/Permeabilization Kitで固定しました。Aのメタノールベースの固定は、アクチン細胞骨格の断片化と細胞の破壊につながります。Image-iT Fixation/Permeabilization Kitは、ほとんどの細胞タイプに対して最適な固定状態を実現します。
1.1 培養条件–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
良い画像を得るための最初のステップは組織の調製です。培養細胞の場合、細胞の状態と形態が良好で、細胞密度が最適である必要があります。健全な細胞イコール健全なデータです。
良い画像を得るための最初のステップは組織の調製です。培養細胞の場合、細胞の状態と形態が良好で、細胞密度が最適である必要があります。健全な細胞イコール健全なデータです。
1.2 固定–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
組織の調製後に行うステップは固定です。固定とは、多くの場合形態を保持するために、特定の生理的状態で細胞を致死させて保存する化学的方法です。適切な固定は、ターゲットの保存に匹敵します。
1.3 透過処理–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
次のステップは細胞の透過処理で、これは細胞内分画を開くための鍵です。
1.4 ブロッキング–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
透過処理の次のステップはブロッキングで、ブロッキング技術は多数存在します。タンパク質のブロッキングは、特異的な抗体結合に相当します。電荷色素のブロッキングはより少ない非特異結合を意味します。
1.5 自家蛍光–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
細胞調製の最後のステップは自家蛍光です。細胞および組織はある程度自家蛍光し、これは特異的シグナルを混乱させ、シグナル／バックグラウンド比を低下させる可能性があります。自家蛍光の克服はより高い感度を意味します。
ステップ2.標識
細胞小器官（オルガネラ）選択的な色素、染色液、および一次抗体により、目的の細胞構造およびタンパク質をターゲット
さまざまなターゲットを別々の蛍光色で標識することにより、同一サンプル中の細胞内の異なる構造またはタンパク質を可視化することが可能です。ターゲットを標識する方法には、蛍光色素、免疫標識、および蛍光融合タンパク質が含まれます。これらはすべて、細胞内の構造および分子を選択的に標識する方法を提供し、イメージングの際にそれらの可視化を容易にします。
細胞生物学用の多くの蛍光ツールは基本的には、さまざまな方法で修飾されたり、さまざまな分子とコンジュゲートされた蛍光色素であり、特定の機能の付加、または特定のオルガネラまたはタンパク質との結合を可能にします。化学修飾により、1つの蛍光色素を、それぞれ異なる特異性を持つさまざまなフォームで作成できます。たとえば、緑蛍光のInvitrogen Alexa Fluor 488色素分子は、アクチンフィラメントをターゲットとするように修飾したり、当社の標識キット用いて免疫標識に使用するためにIgGに結合させたり、または全細胞の染色液として機能します。
主な製品
Invitrogenポートフォリオは、85%を超えるプロテオームへの特異性を有する、51,000を超える高品質な一次抗体を提供します。これらの抗体の一部は、Invitrogen Alexa Fluor色素などの幅広い高蛍光強度マーカーおよび標識に直接結合します。
単一の蛍光色素は任意の数の標識付けが可能で、機能化フォームに修飾することにより、アクチン（A）やチューブリン（B）などの細胞構造成分の標識や、塩フォームに修飾して細胞全体の染色（C）を行うことが可能です。
培養細胞をInvitrogen Image-iT Fixation/Permeabilization Kitを使用して染色用に調製し、Invitrogen BlockAid Blocking Solutionで処理しました。ミトコンドリアを認識する一次抗体でサンプルを標識し、続いてAlexa Fluor 750 Dye–conjugated Secondary Antibody（紫）、Invitrogen NucBlue Cell Stain （青）、およびInvitrogen ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent（緑）で標識しました。画像はInvitrogen EVOS FL Auto Imaging Systemで取得しました。
2.1 一次抗体の選択–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
出版品質の画像を得るために、調製後に行う第2ステップはサンプルの標識で、通常、目的の特定ターゲットに対する一次抗体が関与します。
2.2 一次抗体プロトコルの最適化–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
一次抗体は個別に最適化する必要があります。利用できるプロトコルは多数ありますが、すべての抗体はわずかに異なるため、「一つですべてに対応」というアプローチは好ましくない結果を生じることを理解することが重要です。
ステップ3.検出
蛍光シグナルを解析用に微調整
複雑な生物学的構造の検出は、蛍光シグナルの最大限の鮮明さと、バックグラウンドノイズからのシグナルの分離を必要とします。標準的な免疫蛍光標識で最良のS／Nを実現することはほとんどありません。出版品質の画像を得るには、ピークの特異性、解像度、および増幅度など、サンプルのしぐなるを微調整する必要があります。
Image-iT Fixation/Permeabilization Kitを使用して固定および透過処理したHeLa細胞を、抗チューブリン一次抗体およびAlexa Fluor 488 goat anti–mouse IgG (H+L) Secondary Antibodyとともにインキュベーションしました。次に細胞をAnti–ATP Synthase Subunit IF1 Antibodyとともにインキュベーションし、Alexa Fluor 594 Tyramide SuperBoost Kit（ヤギ抗マウスIgGおよびAlexa Fluor 594 Tyramide）に含まれる試薬で標識しました。核をNucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagentで標識しました。画像は共焦点顕微鏡で撮影しました。
高～中存在量タンパク質ターゲット
二次抗体はターゲットの間接検出に使用されます。一次抗体はターゲットに直接結合しますが、二次抗体は一次抗体を架橋として用いることで、ターゲットの生体分子と間接的に結合します。複数の二次抗体分子が1つの一次抗体分子に結合できるため、この方法はシグナルの増幅と感度の向上に寄与し、検出を最大限まで可能にします。
二次抗体を探す
二次検出では、一次抗体（橙色および黄色）はそれぞれ対応するエピトープに結合し、蛍光色素で標識された二次抗体（紫色および青色）はそれぞれの一次抗体に対する特異性を有し、結合します。
中～低存在量タンパク質ターゲット
ストレプトアビジンコンジュゲートは、ターゲットを標識する蛍光色素の数を増加させ、そのシグナルを増幅します。ストレプトアビジンベースの増幅手法は、一次および二次抗体による検出の感度向上のために蛍光イメージングで広く使用されています。
イメージングのためのストレプトアビジンシグナル増幅の詳細を見る
蛍光色素–ストレプトアビジンコンジュゲートを使用して標識された抗体は、標識実験において弱いシグナルを増幅できます。これは、より多くの蛍光色素が各抗体分子に結合でき、シグナルを増幅するためです。
低存在量タンパク質ターゲット
従来の方法では検出できない低存在量のタンパク質ターゲットに対しては、チラミドシグナル増幅（TSA、PerkinElmer）が、解像度を損なうことなく感度の高い検出を提供します。TSA技術には、過酸化水素の存在下で反応性色素を放出する酵素を使用しており、解像度および鮮明さによりターゲットからバックグラウンドを排除します。
TSAによる低存在量ターゲットのイメージングの詳細を見る
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チラミドシグナル増幅では、エピトープの周囲に高密度な蛍光標識が局所的に堆積することで高感度検出が可能になり、解像度を損なうことなく感度が向上します。
主な製品
Alexa Fluor Plus二次抗体は特許取得済みのPlus色素化学を使用しており、当社のAlexa Fluor組成と比較して4.2倍のS／N比を実現しているため、低存在量のターゲットを検出できる高い感度を提供します。
Invitrogen Tyramide SuperBoost KitはInvitrogen SuperBoost技術を使用しており、低存在量のタンパク質ターゲットに対する最高レベルの感度の蛍光イメージング検出法を提供します。SuperBoostキットは、標準的な免疫化学（ICC）、免疫組織化学（IHC）、およびin situハイブリダイゼーション（ISH）手法の10～200倍の感度を実現し、高解像度イメージングに必要な優れたシグナル増幅、解像度、および鮮明さを提供するようデザインされています。SuperBoost試薬はAlexa Fluor色素の高輝度性能を、実績のあるポリHRP介在チラミドシグナル増幅と組み合わせており、他のサプライヤーの試薬を含む標準的な処理方法の2～10倍の感度を実現しています。
3.1 二次抗体の選択–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
出版品質の画像を取得する5ステップの3つ目は標識の検出です。これは、たとえば二次抗体で検出することや増幅手法、また、どのコントロールを使用するかを決定することです。その選択肢について説明します。
3.2 二次抗体の最適化–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
二次抗体検出プロトコルも、使用する一次抗体別に最適化する必要があります。
3.3 増幅手法–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
標準的な二次抗体による検出でシグナル強度が十分でない場合、増幅手法を用いてシグナルを増強できます。これは、発現量の低い抗原、またはサンプル中の希少細胞の検出に特に重要です。
3.4 コントロール–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
非特異的結合や非特異的シグナルの可能性をなくすために、必要なすべてのコントロールをおく必要があります。コントロールのタイプについて説明します。適切なコントロールは、最終結果への自信を高めます。
3.5 色素の選択と特別な検討事項–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
可視光線、遠赤線、赤外線の波長を有する色素を各種取り揃えています。実験に適した色素を選択するうえで考慮事項を説明します。
ステップ4.保護
蛍光シグナルを光退色から保護し高解像度で画像品質を向上
蛍光色素は高品質の細胞イメージングを得るために最適ですが、光退色、すなわち蛍光シグナルの光化学的分解または減退がどうしても生じやすくなります。感光性が少しでも減少すると、データにゆがみが生じ、誤った結果が生じる可能性があります。退色防止マウント剤は、蛍光色素の光安定性を保護し、画像の完全性を数週間から数ヶ月にわたり維持するようデザインされています。
主な製品
Invitrogen ProLong Glass antifade mountantsは、可視および近赤外スペクトル領域全体にわたり卓越した退色防止効果を提供するようデザインされています。ProLong Glassマウント剤は1.52の屈折率を有し、多数の蛍光色素と併用して、0.1 µm～150 µmの事実上あらゆる細胞または組織サンプルに使用でき、高輝度かつ高解像度のZスタック、3D、および2D画像を実現します。画像のひずみがより小さいため、油浸レンズおよび共焦点顕微鏡で特に有効です。
固定細胞用ProLong antifade mountantsの主な利点：
- 長期保存後でも、広いスペクトル領域で光退色を抑制
- スペクトル全域で低バックグラウンド
- 硬化マウント剤
- DAPI含有または不含タイプをご用意
- ベンチトップですぐに使用できる剤形
- 必要に応じて屈折率を選択：ProLong Glass試薬では1.52、ProLong DiamondおよびProLong Gold試薬では1.47
ProLong antifade mountantsによって可能な光退色耐性の向上を示す60秒間の経時的変化。固定HeLa細胞をfluorescein phalloidinで標識し、ProLong Glass reagent、ProLong Diamond reagent、ProLong Gold reagent、または50% PBS／グリセロールで封入しました。画像は、一般的な100ワット水銀アーク灯からの連続照射と20倍対物レンズを使用し、12秒間隔で取得しました。
4.1 マウント剤–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
適切な封入剤を使用すると、実験に効果が波及する可能性があります。お客様の条件に合った適切なタイプのマウント剤を確実に選択してください。
4.2 光退色と退色防止剤–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
光退色の定義、光退色によるサンプル棄損の防止法退色防止剤の選択肢について説明します。
ステップ5.イメージング
最大限の鮮明さと解像度でイメージングの発見を保存
このステップを最適化して、研究上の発見を最大限の鮮明さと解像度で保存できます。今日の競合的な科学環境において、出版品質の画像作成は成功に不可欠です。最高品質の画像を取得するには、次のような最上級のイメージング要素を備えたイメージングプラットフォームが必要です。
- 高画質なイメージデータを保存できる高解像度カメラと光学系部品
- 優れたS／N比を実現するLED光源システム
- わずかな操作で画像を保存し、画像処理や解析ができるソフトウエア
- 広範囲の定量および統計解析を可能にする画像解析性能
主な製品
実験のニーズに合わせて調整できる、使いやすいモジュール式のシステムを選択してください。さまざまなLEDライトキューブ、ベッセルホルダー、および対物レンズでカスタマイズ可能なイメージングシステムを提供しています。選択できるInvitrogen EVOS LEDライトキューブは13を超え、幅広い蛍光励起および発光をカバーしています。
サンプルのスループットを増やして、より多くの定量データを取得する必要がありますか？CellInsight CX5 High Content Analysisプラットフォームは、自動画像キャプチャ機能と同時データ解析機能を提供し、最大50万個の表現型細胞測定を5分以内で解析することが可能になります。
以下でイメージングシステムを比較し、最適な機器を見つけてください。
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蛍光の迅速視覚化に最適
| ベーシックな透過光デジタル倒立システム | 高度な透過光デジタル倒立システム | ベーシックな蛍光システム | 高度な蛍光システム | 完全 自動蛍光システム |
|---|---|---|---|---|
EVOS XL Core 細胞培養およびルーチンの細胞維持に最適 | EVOS XL（販売終了） 高度 比色解析アッセイに最適 | EVOS FLoid 蛍光の迅速視覚化に最適 |
|
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当社のハイコンテントアナリシス細胞イメージングシステムの全ラインアップに関する詳細情報を見る
| 5チャンネルLEDシステム | 7チャンネルLED共焦点システム | 7チャンネルレーザー共焦点システム |
|---|---|---|
CellInsight CX5 規模拡大のための小型でお手頃価格のシステムを求めている研究室に最適 試薬を見る | CellInsight CX7 LED Pro より多くのイメージングモードの選択肢を求めている研究室に最適 試薬を見る | CellInsight CX7 LZR Pro 感度とスピードのより高度な性能を求めている研究室に最適 試薬を見る |
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5.1 イメージングプラットフォーム-ハードウェア–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
プロセスの5番目のステップは実際のイメージングです。最高品質の画像を取得するには、最上級のイメージング性能を備えたイメージングプラットフォームが必要です。ここでは、最高の画像を得るための検討事項について確認します。
5.2イメージングプラットフォーム-ソフトウエア–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
顕微鏡での画像撮影には通常、画像の撮影を補助し、さまざまな色を組み合わせて1つにするサポートをするイメージングソフトウエアが必要です。出版品質の画像を得るためには、留意すべき非常に重要な点がいくつかあります。
5.3 EVOS FL Auto 2.0による画像取得–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
ここでは、画像取得にEVOS FL Auto 2.0イメージングシステムを使用することの利点を説明します。
5.4 Cellesteソフトウエアでの画像解析–固定細胞イメージング：公表に耐え得る品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
Cellesteソフトウエアの機能を解説し、さまざまなソフトウエアプログラムで画像を処理する際の考慮事項を説明します。
5.5 倫理上の検討事項–固定細胞イメージング：出版品質の固定細胞イメージングを実現する5ステップ
倫理的なイメージングとは、信頼に足るデータ、すなわち論文掲載品質のデータを作成することを意味します。データの完全性を維持するためのサンプルおよびデータの取り扱い方を示します。
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