蛍光ラベリングのための固定細胞の処理方法

固定および透過処理の基礎

細胞を固定および透過処理すると、通常細胞がその場所にロックされ、抗体などのより大きな分子が細胞内にアクセスできるようになるので、目的のタンパク質または状態をより効率よくターゲティングできます。しかし固定および透過処理をすると細胞は死んでしまい、動的な生物学的プロセスは観察できなくなります。

以下にご紹介する情報をご覧になり、固定および透過方法がお客様の研究に適した方法かどうか判断する材料にしてください。

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図 1. ホルムアルデヒド固定は、本質的に細胞構造をその場にロックします。

細胞の固定後に、蛍光染色がシグナルを保持する能力は、染色の種類によって異なります。一部の染色試薬では、細胞が生きている間に蛍光標識を行い、その後固定を行ってもシグナルは消失しません。しかし、より一般的な手法としては、細胞を固定、透過処理、ブロッキングした後に、蛍光色素および／または抗体コンジュゲートで染色を行います。

ホルムアルデヒドは最もよく使われる固定剤であり、タンパク質など、隣接する巨大分子同士を化学的に結合させる働きがあります。この過程は架橋として知られています。最も入手しやすいホルムアルデヒド剤は、実際には水またはバッファーに溶解されているパラホルムアルデヒド（PFA、重合ホルムアルデヒド）です。ホルムアルデヒド溶液中の遊離メタンジオールはタンパク質のアミン基および窒素を含む細胞構造と反応します。PFAはまた、細胞膜に存在する脂質の一部を可溶化します。PFAは一般的に3.7～5% v/vに希釈されており、細胞の処理は10～15分間行います。

透過処理方法

透過処理のステップでは細胞膜の脂質をさらに取り除き、抗体のような大きい分子が細胞内へ浸透できるようにします。Triton® X-100およびNP-40は0.1～0.5%（v/v、PBSによる希釈）で透過処理に一般的に使用される界面活性剤です。透過処理の時間はまず10～15分間を試すのが良いですが、ターゲットによって上手くいかなかった場合は処理時間を短くするか、または別の界面活性剤を検討する必要があるかもしれません。またこれらの界面活性剤は核膜も透過処理するため、様々なターゲット部位に適しています。

図 2. 透過処理ステップで細胞膜脂質を取り除くことにより、大きな分子が細胞内部へアクセスできるようになります。

図 3. タンパク質をベースとしたブロッキング剤を使用することで、非特異的染色を抑えられます。

固定および透過処理を行った細胞で、抗体による標識を行う場合には、一次抗体の前にブロッキング溶液を使用すると良い結果を得られることがあります。通常、ブロッキングを行う溶液は過剰なタンパク質を含んでおり、これによってサンプルにおける非特異的な結合を低減させます。お使いの一次抗体または二次抗体が、サンプルにおいてターゲットでない分子と結合しやすい傾向がある場合、ブロッキングが重要になります。非特異的な「バックグラウンド」染色は多くの場合、抗体と非ターゲット分子間の疎水的相互作用によるものですが、これを抑えることで陽性のシグナルを同定しやすくなり、より明瞭な結果を得られます。

ICCで最もよく使用されるブロッキング溶液は3% (w/v) ウシ血清アルブミンPBS溶液および／または二次抗体の生物種と同じ動物由来の10% (v/v)非働化的血清PBS溶液です。例えばマウス抗ウサギIgG二次抗体を使用する場合は、非働化したマウス正常血清を用いてブロッキング溶液を作ります。