フローサイトメーターを購入する際の留意事項

フローサイトメーターにおける光学系の能力は、どのように実験をデザインし実行するかに直接影響します。レーザーは、細胞の様々な成分や様相の検出に使用する抗体や試薬に結合させた蛍光色素を励起する光を供給します。  検出器は特定波長の光を捕捉し、増幅・分離する装置で、測定した蛍光色素に特異的な物性的情報を提供します。レーザーと検出器におけるテクノロジーは、実験に使用した蛍光色素の数や種類を決定します。このため、最適なデータを得るために、光学系を構成する数多くのコンポーネントの選択肢について理解することが重要なのです。

細胞の同定および物性解析は、レーザービームの出力と検出システムの感度に左右されます。ほとんどの実験では、細胞集団、細胞サイクル、集団倍加、アポトーシス、細胞生存率を分析するために、細胞表面や細胞内タンパク質を標識する複数の蛍光色素を必要とします。高品質なコンポーネントによる優れた光学系は、細胞の生物学的および生化学的特徴を幅広く捉えることができます。

色素はそれぞれ励起エネルギー領域と、特異的な蛍光スペクトルを持っています。細胞は、複数の蛍光標識抗体、蛍光色素、蛍光タンパク質で標識できます。レーザーは、異なる量の励起エネルギーを供給するために、特定の波長においてその出力を放射します。

蛍光色素の中には、効率の異なる複数の励起波長を持つものがあります。例えば、PE は 488 nm の青色または 561 nm の黄色のどちらのレーザーによっても励起されます。488 nm の青色レーザーは、より低いエネルギーレベルでPEを励起します。561 nm の黄色レーザーは、蛍光色素をより強く励起し、より大量の光子を放出させます。561 nm の黄色レーザーによるより強い励起光は、そのレーザーがない装置では観察されないようなぼんやりとした小さな細胞集団を分離できる可能性があります。

多くの市販のフローサイトメーターは、紫色（405 nm）、青色（488 nm）、緑色（532 nm）、黄色（561 nm）、赤色（640 nm）のレーザーを搭載できます。基本装置は通常 488 nm の青色レーザーを搭載しています。レーザーを追加すれば、1 つの実験に使用できる蛍光色素の数を増やすことができます。紫色、青色、黄色、緑色、赤色レーザーがあれば、複数の蛍光を使用する実験においてほとんどの蛍光色素を励起できます。350 nmのUVレーザーを搭載できるフローサイトメーターもあり、マルチカラー実験デザインにおいて、励起および蛍光波長の幅を押し広げることができます。

実験において蛍光シグナルを細胞間で比較するためには、全ての細胞が同じレーザー励起エネルギーを受け取らなくてはなりません。正確なレーザーアライメントによる一貫したレーザービーム出力は、インテロゲーションポイントを通過した全ての細胞に最適なシグナルを送ります。正確にアライメントされたレーザービームにより、装置由来ではなく生物学的な変動のあるデータが得られます。

蛍光シグナルの弱い細胞を含むサンプルでは、最適でない励起エネルギーによって結果がネガティブとなる場合があります。レーザー出力が一定でない場合、細胞からの蛍光シグナル間にばらつきが生じ、統計誤差が大きくなります。レーザーアライメントにずれが生じると、ビームを通過した各細胞に弱い、または同等でない励起エネルギーを供給することになります。

ほとんどのフローサイトメーターのレーザービームはガウス分布です。最適な励起エネルギーを得るために、細胞はビームの中央を通過しなければなりません。

最近開発されたフラットトップレーザーのプロファイルは、蛍光色素を励起するためにより広い領域をカバーします。エネルギー分布が均一なため、サンプル中の細胞が均等にエネルギーを受け取ることができ、一貫した結果が得られます。

1 つの装置内に搭載された複数のレーザーは、2 種類の方式によって配置されているのが一般的です。配置の方式は、実験で使用する蛍光色素の数と、細胞からの蛍光の検出の両方に影響を及ぼします。

レーザーの共線上配置では、全てのレーザー光を 1 つの領域にフォーカスして同時に照射することで、複数の蛍光色素を同時に励起します。

この配置方式では、複数の蛍光シグナルが同時に励起され、大きな補正が必要となり、マルチカラーパネルの構築における柔軟性が低くなります。レーザーの共線上配置は、波長の異なるレーザーが、蛍光スペクトルの重なりが少ない、または重ならない蛍光色素を励起する場合に効果的です。低価格のフローサイトメーターは、コンポーネントのコストを抑えるためにこの配置方式を採用している場合があります。

空間的に離して配置する方式では、細胞のフローに対して段階的にレーザーを照射します。複数の蛍光色素で標識した細胞は1つずつそれぞれのレーザービームを通過し、異なるタイミングで励起または蛍光スペクトルの検出が行われます。この配置方式では、1 つの実験で使用する色素の数を柔軟に決定することができます。個別に励起された蛍光シグナルは、より高い感度を示し、補正の必要性も低下します。この配置方式では、類似の蛍光スペクトルのオーバーラップを劇的に減らすことができるため、大規模なマルチカラーパネルの構築に便利です。

励起された蛍光色素は、特定の波長ではなく、限られたスペクトル範囲で光を放出します。放出された蛍光は、それを捉えて解析する前に光学フィルターを通過させる必要があります。フィルターによって蛍光を分離しない場合、複数の色素から放出された蛍光が重なり、解析が難しくなります。

複数の蛍光色素標識抗体で標識した細胞が、光学フィルターの開発によって分析可能となりました。簡単に入手でき、ユーザーによって交換できるため、これらの光分離コンポーネントが、フローサイトメーターにおける蛍光分離に最も多く使用されています。異なるフィルターを組み合わせることで、小規模および大規模なマルチカラーパネルの作成における多様な色の組み合わせが可能となります。これは耐久性のあるコンポーネントによる信頼されたシステムです。簡単に交換できるフィルターを備えたシステムをお求めください。

スペクトル型のフローサイトメトリーは、従来のフローサイトメトリーとは異なります。このテクノロジーを備えた装置では、可視光スペクトルにおいて放出された蛍光をフォーカスするプリズムを使用しています。複数の蛍光色素から放出された蛍光は重なってしまうため、次なるステップとしてそれらを分離するために複雑なアルゴリズムが必要です。このテクノロジーの利点は、少ないレーザー数でもカラーチャンネルの総数を増やすことができることです。このテクノロジーはフローサイトメトリーではまだ発展途上であり、コンピューターによる蛍光分離が特定の蛍光色素では制限される可能性があります。

1 つの細胞から放出される蛍光シグナルは微弱です。データを解析するためには、光を調整可能な形式に変換する必要があります。蛍光検出装置は蛍光を捕捉し、光波を電子シグナルへと変換します。これにより個々の電子シグナルが増幅でき、ユーザーによるデータ処理が可能となるため、このステップは重要です。

光電子増倍管（PMT）は、ほとんどのフローサイトメーターに使用されている検出装置です。光路の最後に複数の PMT が並び、フィルターを通過したそれぞれの蛍光シグナルを捕捉します。このタイプの検出装置は、UV から IR まで幅広いスペクトルにおいて、非常に弱いシグナルから非常に強いシグナルまで直線的に蛍光のダイナミックレンジを PMT により捕捉できるため、マルチカラーパネルの実験に有用です。

他の検出装置には、放出された蛍光からの電子を伝導し増幅するアバランシェフォトダイオード（APD）があります。遠赤外スペクトルの蛍光色素を主に使用する実験には APD が向いています。これらの検出器は、赤色および近赤外スペクトル領域において放出されたシグナルを効率よく捕捉します。

フローサイトメーターでは、サンプルの細胞や他の成分に由来する自家蛍光としてのバックグラウンドが検出されることがあります。標識した細胞の物理的性質を完全に視覚化するには、陽性のシグナルはもちろん陰性の（弱い）シグナルまで幅広く捕捉する必要があります。言い換えれば、使用した蛍光色素のシグナルと細胞由来の検出され得る（または陰性の）自家蛍光を最大限に分離して観察するために、理想的な PMT 電圧を設定しなければなりません。

細胞サンプルを分析する前に、それぞれの PMT に最適な電圧を調べるため、蛍光スタンダードを使用してフローサイトメーターの PMT 電圧を最適化する必要があります。

必要であれば、特に陽性のシグナルが強すぎる場合には、PMT 電圧を調節した方がよいでしょう。染色していない細胞をバックグラウンドシグナルのためのネガティブコントロールとして使用し、電圧を調節できます。PMT 電圧を下げることで、陽性のシグナルの適切な測定が可能となり、また陰性集団のシグナル値を下げることができます。

フローサイトメーターによって検出された蛍光シグナルの量は、電圧設定によってコントロールできます。電圧の上げ下げにより、蛍光シグナルを適切に測定するための PMT 検出器のゲインを調節できます。

ロックされた電圧設定はシンプルなフローサイトメーターの機能の一部ですが、そのような装置の蛍光検出の範囲は限られたものになります。ユーザーがバックグラウンドと陽性の細胞集団を区別できなければならないため、電圧設定の調節は簡単ではありません。慣れていないユーザーは、電圧を適切に調節できないかもしれません。そのようなユーザーのために、小規模な蛍光色素パネルとその検出器用に電圧がロックされているのです。電圧設定がロックされた装置は、設定の変更を制限することでプロセスをシンプルにしています。

ロックされていない調節可能な電圧設定は、マルチカラーパネル実験を行うユーザーに好まれます。ロックされた電圧設定では、限られた蛍光色素パネルから放出された蛍光の検出のための設定がされています。調節可能な電圧設定では、蛍光色素パネルの設定に制限がありません。この特徴により、大規模なパネルの設計や、様々な色素タイプの選択が可能になります。調節可能な電圧設定では、PMT シグナルをスケール内に収めるため、シングル染色のポジティブコントロールをチェックすることもできます。また、マルチパラメーターによるフローサイトメトリー実験の一部として最適なシグナル補正を行うためにも、PMT 電圧を調節できます。

複数の蛍光色素は、可視スペクトルにおいて幅広い蛍光を放出します。マルチカラーパネルによるデータ収集では、蛍光シグナルの重なりが発生します。この場合、陽性の単一標識細胞が二重陽性に見えてしまうといった問題が起きます。

補正とは、アルゴリズムのセットを用いてそれぞれの蛍光色素のシグナルを分離することです。従来の補正では特定の波長を分離します。このプロセスでは、それぞれの蛍光色素を個別に測定し、アルゴリズムを使用して補正値のマトリクスを作成します。これらの補正がスペクトルの重なった部分に適用され、個々の値が得られます。このプロセスではシグナル補正を簡単に素早く計算します。

スペクトル非混合タイプは、従来の補正法とは異なり、1 つの波長に対して蛍光スペクトルを与えます。

PMT および APD において、蛍光を捕捉するためのコンポーネントはチャンネルと呼ばれます。フローサイトメーターによって検出される蛍光色素の数は、利用できるチャンネルの数によって決まります。

1レーザーシステムでは複数のチャンネルを持つことができます。  これは 1 つのレーザーが複数の蛍光色素を励起でき、検出器がサンプルの発する異なる波長の蛍光を捕捉できることを意味します。このタイプの実験では、全ての蛍光色素が重なった波長において蛍光を発するため、複雑な補正が必要です。

複数のレーザーがあれば、より多くのチャンネルを提供できるため有用な場合があります。チャンネルを追加すれば、蛍光色素の選択の幅が広がり、また補正を少なくできるため、パネルデザインが容易となります。これにより、細胞集団をより適切に分離した実験が可能になります。