Review selected protocols that are commonly used to spectrophotometrically quantify the concentration of an oligonucleotide or primer solution: how to concentrate or precipitate an oligo, how to PAGE purify oligos, and how to build adaptors with your oligos.

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1. 分光学的なオリゴヌクレオチド定量方法:

1000 µLのddH2Oを乾燥したオリゴヌクレオチドに加えて、その後にボルテックスミキサーまたはピペッティング操作で15秒間処理することにより相を均一としたStock Solutionを調製します。このStock Solutionの一部の260 nmにおける吸光度(A260)を計測して、次に示す計算式により算出します。(直接Stock Solutionを分光光度計で計測すると高濃度であるため、分光光度計の測定範囲を超えてしまいます。そのため、正確な吸光度を得ることが出来ませんのでご注意ください。)

濃度（µg/mL）=A260 × 重量/ OD( µg/ OD) × 希釈率

希釈率（Dilution Factor）は1000µLに溶解したStock Solutionをさらに希釈した時の希釈倍数です。
例えば、Stock Solutionより50µLを採り、これにddH2O (950μL)を加えて1000µLとした場合、希釈率は20　（1000/50= 20）となります。

計算例：Stock Solutionより50µLを採り、これにddH2O (950μL)を加えて1000µLとしたものの260 nmでの吸光度が0.5であり、重量/ OD( µg/ OD)が35であれば、
希釈率= 1000 µL/ 50 µL=20
濃度= A260 x重量/ OD( µg/ OD) × 希釈率= 0.5 × 35 × 20 = 350µg/mL

 

How to resuspend primers


How to dilute primers

2. プライマー濃度または溶解に必要な溶媒量の計算方法

例1: 24nmoleと添付された分析書（COA）に記載されているオリゴヌクレオチドを1mLのddH2Oに希釈すると、
24 nmole/ 0.001 L(1mL)= 24000 nmole/L または24000 nM
nmole表示からµmole表示に変換すると、
24000 nmole/L = 24 μmole/L または　24 µM (1000 nmole= 1µmole)

解説: 溶解したオリゴヌクレチドの体積をミリリットルからリットルへ換算しました。そしてオリゴヌクレオチドのnmoleをddH2Oの体積で割り、nmoleでのモル濃度(nmole/L)に換算しました。nmoleをµmoleに変換することによりµmoleでのモル濃度（µmole/LµM）に変換しました。

例2: 100µMプライマー　ストックの作り方:
24nmoleと添付された分析書（COA）に記載されているオリゴヌクレオチド：
µmoleに換算すると
24nmole= 0.024 µmole (1000 nmole= 1µmole)
0.024 µmole/ 100 µmole/liter= 0.00024 L
0.00024 L x 1000ml/L= 0.24 mL または240 µL

解説：最初にnmoleからµmoleに換算を行い、そしてµmole/Lにおける希望の濃度に調製をします。Liter（リットル）換算での必要なVolume（体積）を算出するためにµmoleを相殺します。それから、Liter（リットル）からmL（ミリリットル）へ単位換算を行います。このようにして、0.24mLの100µM調製溶液を得ます。

例3: OD値よりの計算：プライマーの吸光度 (OD)が0.14の場合:
（Stock Solutionから10 µLを採り、全量を1000 µL(1 mL)として測定時）
COAにµg/ODが36.6と記載されている例
0.14 OD/mL x 1000µL/10µL= 14 OD/mL　(Stock Solution全量のOD値)
14 OD/mL x 36.6 µg/OD = 512.4 µg/mL

解説: Stock Solution 全量の吸光度は、Stock Solutionから採った一部の溶液の測定で得られた吸光度と希釈率を掛けることにより得られます。COAに記載されている　µg/ODにStock Solution全量の吸光度を掛けると求めるオリゴヌクレオチドの1mL当たりの重量（µg/mL）が得られます。

例4: COAに示されている分子量（理論値）と記載されている1ミリリットル当たりのモル数より（µmole/mL）オリゴヌクレオチドの溶液中での重量（µg/mL）を求める場合:

7440.9 g/mole= 7440.9 µg/µmole
7440.9 x 68.6 µmole/L= 510445.74µg/L
510445.74µg/L x 1L/1000mL

解説：g/moleとµg/μmoleは同義です。µg/µmoleで表示される１µmole当たり重量は例3に示したµM濃度と分子量の乗数より得られます。

 

 

Protocol for PAGE purification of oligos

The following protocol, excerpted from the Invitrogen GeneTrapper Manual, outlines the steps for PAGE purification of oligos. Please note the resolution is poor on precast mini polyacrylamide gels for smaller (<25 nt) oligos.

  1. Use a 1.5 mm gel with well forming combs (not sharkstooth combs).
  2. Prepare a 12% acrylamide gel (19:1) with 8 M urea and 1X TBE.
  3. Dissolve a 5–10 OD of oligo (approximately 1 OD = 33 µg) in 25 µL TE. Add equal volume of formamide to the oligo and heat to 95°C for 1 min. Chill on ice. To avoid masking the location of the oligo (when detected by UV shadowing) do not add dye to the formamide. We suggest an outside lane not containing oligo have the dye added for tracking purposes.
  4. Flush wells before loading oligos. Always leave a space between lanes containing different oligos. Electrophorese 20–30 cm.
  5. Place gel on a piece of plastic wrap and then on an X-ray intensifying screen (intensifying side up towards gel). Examine gel with short wave UV light from above (without ethidium bromide staining). The oligo band(s) will appear as a dark shadow.
  6. Excise the areas of the gel containing the full-length oligo. Crush the gel slice and elute the oligo in 1 mL TE overnight at 37°C with shaking.
  7. Transfer the eluted solution to a fresh tube with a 1 mL pipette. Wash the gel slice with a 200 µL of TE and combine with the eluted solution. Measure the total volume of the eluted oligo.
  8. After washing a PD 10 column with 12 mL of autoclaved water, add the eluted oligonucleotide to the column and discard the flow through.
  9. Wash the column with autoclaved, distilled water, using a volume equal to 2.5 minus the total volume of the eluted oligonucleotide which was loaded onto the column. Discard the wash flow through.
  10. Elute the oligonucleotide by adding 1 mL of autoclaved, distilled water to the column and collect this fraction in a sterile tube. Add another 1 mL of autoclaved distilled water and collect it in a second tube.
  11. Dry the oligo under vacuum.
  12. Dissolve the oligo in 100µL of TE.
  13. Add 100 µL of phenol:chloroform:isoamyl alcohol and vortex thoroughly. Spin at room temperature for 5 minutes at 14,000 x g. Remove 90 µL of upper aqueous layer and transfer it to a fresh tube.
  14. Add 45 µL of 7.5 M NH4OAC and 350 µL absolute ethanol. Vortex to mix, store on ice for 10 minutes, and spin for 10 minutes at 14,000 x g at 4°C.
  15. Remove supernatant, wash pellet with 70% ethanol, and dry the oligo.
  16. Dissolve the oligo in 60 µL TE. Verify the oligo concentration using OD measurement, making sure the oligo concentration is greater than 0.5 µg/µL.

Explore DNA electrophoresis products

  • Bring the oligo solution to 65°C in a water bath. Maintain the temperature at exactly 65°C for 10 minutes. It is critical to maintain the oligo at exactly 65°C for the entire 10-minute duration.
  • Remove the solution from the water bath and allow it to cool slowly at room temperature for 1–2 hours.
  • Store the adapter at –20°C until ready to use.

*10X Annealing Buffer Recipe
Mix the following components for a 50 mL stock solution:

StockAmountFinal concentration
1 M Tris-HCl (pH 7.5)5 mL100 mM
5 M NaCl10 mL1 M
0.5 M EDTA1 mL10 mM
DEPC-treated water34 mL–

 

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Stylesheet for Classic Wide Template adjustments

3. オリゴヌクレオチドのエタノール沈殿:

下記のプロトコルは20塩基以上の鎖長で、量が0.1 OD以上存在する場合に使用できます。もし、量がそれに満たない場合にはtRNAのようなキャリアーを用いてください。

  1. マイクロチューブ中にオリゴヌクレオチドを乾燥させます。
  2. 0.3M 酢酸ナトリウム水溶液(pH 7)を0.2mL加えて、ボルテックスミキサーで処理を行い、相を均一にします。
  3. -20 °Cに冷却した高純度エタノール0.6mLを加えて、4 °C下で30分静置します。
  4. 遠心　(10000 × g)を30分間行います。
  5. 底部のペレットが舞い上がらないように、上清を取り除いてください。
  6. 冷却した70% エタノール 1mLを加えてください。
  7. 遠心　(10000 × g)を10分間行います。
  8. 底部のペレットが舞い上がらないように、上清を取り除いてください。残ったペレット部分を乾燥します。
  9. このペレットはオリゴヌクレオチドです。-20°Cで保管をお願いいたします。

 

4. オリゴヌクレオチドのPAGE精製

オリゴヌクレオチドの分析・精製の手法としてPAGE精製は一般的な手法です。分析・精製するオリゴヌクレオチドの鎖長により、使用するアクリルアミドの濃度は異なります。アクリルアミドの濃度は次に示しますLinkをご参考に決定してください。

泳動条件は作成するゲルのサイズなどにより異なりますが、ここではNOBEXC TBE-Urea (size; 10 cm x 10 cm x 1.5mm)を用いた例を挙げます。

  1. ゲルの厚さ1.5 mmゲル板と10ないし12wellのCombをご用意ください。
  2. 16%アクリルアミド-8M Urea-1 x TBEの変性ゲルを作成します。これをTEMEDにより架橋をします。
  3. 作成されたゲルの1 well当たり3 µg相当のオリゴヌクレオチド溶液をゲルローディングバッファー（Novex; cat.No. LC6876またはAmbion;Cat.No. AM8546G）と混合してアプライします。
  4. 電圧170 Vで1時間泳動をします。
  5. 泳動後、ゲル板よりゲルを取り外し、エチジウム・ブロマイドによる染色を行います。
  6. UVライトを照射して、染色されたゲルの主たるバンドを切り取ります。
  7. 切り取ったゲルよりオリゴヌクレオチドの抽出を行います。TE Buffer (pH 8.5)中で終夜、震盪します。(37 °C)
  8. 抽出された溶液をエタノール沈殿します。
  9. エタノール沈殿で得られたペレットを風乾します。

 

5. アダプターDNA/ 二本鎖DNA作成プロトコル:

アダプター遺伝子や二本鎖DNAを作成する際はPAGE精製のオリゴヌクレオチドを用いることをおすすめします。また、一般のHPLC精製品やカートリッジ精製品も作成に用いることは出来ます。

アダプター遺伝子や二本鎖DNAを作成する際は作成するそれぞれのオリゴヌクレオチドの濃度が、同じになるように濃度の調製を行います。濃度はモル表示で、吸光度より求めます。

nmole= A260 x nmole/OD x 希釈率

濃度調製された各コンポーネントを併せます。（それぞれのコンポーネントのオリゴヌクレオチドと全量でのアニーリング濃度を計算する必要があります。）

一般的な調製組成
オリゴヌクレオチド 1100 nmol
オリゴヌクレオチド 2100 nmol
10 X アニーリング　バッファー *
1X DEPC水


65°C以上に設定したウオーターバス（またはヒートブロック）にて上記の調製した溶液を加温します。このオリゴヌクレオチド溶液を65°Cにて10分加温します。（アニーリングをする際は、断続的な加温ではなく、少なくとも10分間程度の継続的な加温を施すようにしてください。）
加温後、加熱機器よりオリゴヌクレオチドを外して、徐々に1～2時間程度の時間を要して冷却をします。

得られたアダプター遺伝子/二本鎖DNAは-25°Cで保管してください。

10 X アニーリング　バッファー　(50 mL)

Stock Solution量　(mL)終濃度
1 M Tris-HCl (pH 7.5)5100 mM
5 M NaCl101 M
0.5 M EDTA110 mM
DEPC水34 

 

6. モル吸光度を用いたオリゴの重量の算出法:

ご注文の際に重量でご注文をなされる場合は当社で換算をして、適切な合成スケールと推定量をお客様にご連絡します。
お客様の方で算出をなさる場合は、添付されている商品説明書の分子量・モル吸光度係数によりDNAまたはRNAの重量を求めることができます。

方法といたしましては下記の通りとなります。

  1. 希望配列のモル吸光度係数を求めます。（この総和は、希望配列の1µモルのOD値となります。）
  2. 当社Webに掲載しております保証収量（OD値）から保証収量のモル数を換算します。
  3. 添付の商品説明書または弊社Webに掲載されております分子量計算式より希望配列の分子量を求め、2で求めました希望配列の保証収量でのモル数より、希望配列の重量を換算します。これにより、該当合成スケールの本数の計算が可能となります。

【算出例】

（OD値は配列の構造多型などの影響により“理論値”とは異なる場合があります。）

（配列）GCGCAATTGCGC 「12塩基」
（精製グレード）HPLC

（分子量）=[{(#Ax 313.2)+ (#Cx 289.2) + (#Gx 329.2)+ (#Tx 304.2) -62] +1
 =[{(2x 313.2)+ (4x 289.2) + (4x 329.2)+ (2x 304.2) -62] +1
 =3647.4
（モル吸光度係数Ec）=(#A x 15.3)+ (#C x 7.4) + (#G x 11.8)+ (#T x 9.3)
 =(2x 15.3)+ (4x 7.4) + (4x 11.8)+ (2x 9.3)
 =126

希望配列の1μmoleあたりのOD値の総和は126です。

当社の保証収量は1µmoleスケール合成、HPLC精製で10 ODのため、モル数は「10/126=0.0794µmol」となります。（最低保証収量）

このモル数に求めた分子量を掛ければ、最低保証収量あたりの重量が算出されます。
（0.0794ｘ3647.4=289.60 ug）
この重量をご希望の量で割ると、何本の希望配列をご注文すればよいかご判断いただけます。
上記内容でHPLC精製品「1mg（1000µｇ）」以上が必要な場合は、1µmole スケール合成品を4本ご注文いただければ、ご希望量が確保できます。

分子量
Normal:
Mw=[{(#A x 313.2)+ (#C x 289.2) + (#G x 329.2)+ (#T x 304.2) + (#U x 290.2) + (#I x 314)+ (#N x 309)+ (#B x 307.5) + (#D x 315.5)+ (#H x 302.2) + (#K x 316.7)+ (#M x 321.2) + (#S x 309.2)+ (#V x 310.5)+ (#W x 308.7)+ (#X x 309) + (#Y x 296.7)+ (#A(ribo) x 329.2)+ (#C(ribo) x 305.2) + (#G(ribo) x 345.2)+ (#U(ribo ) x 306.2)+ (#I(ribo) x 330.2) }-62] +1

モル吸光度
Ec= (#A x 15.3)+ (#C x 7.4) + (#G x 11.8)+ (#T x 9.3) + (#U x 10.1) + (#I x 12.25) + (#N x 10.95) + (#B x 9.5) + (#D x 12.1) + (#H x 10.7) + (#K x 10.6) + (#M x 11.4) + (#R x 13.6) + (#S x 9.6) + (#V x 11.5) + (#W x 12.3) +(#X x11.0)+ (#Y x 8.35)+ (#A(ribo) x 15.3)+ (#C (ribo) x 7.4) + (#G (ribo)x 11.8) + (#U (ribo)x 10.1) +(#I(ribo) x 12.25)

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.