オリゴヌクレオチドに関するテクニカルリソース

＜合成＞

• S-Q1. カスタムDNA（合成DNA）はどのように合成されますか？
• S-Q2. 合成効率とは何ですか？
• S-Q3. 合成効率とはそんなに重要なのですか？
• S-Q4. どれ位の量が得られますか？
• S-Q5. どれくらいの長さのDNAまで注文できますか？
• S-Q6. PCRアプリケーション用の合成スケールについて教えてください。

＜精製＞

• P-Q1. なぜ、精製は必要なのですか？
• P-Q2. 精製には具体的にはどのような種類がありますか？
• P-Q3. HPLC精製時のチャートについて

＜修飾＞

• M-Q1. WebやカタログにCy™5やCy™3などの蛍光標識などの修飾サービスが見当たりません。
• M-Q2. TaqMan Probeは受注しないのですか? また、Dark Quencher®は取り扱わないのですか？
• M-Q3. チオール修飾オリゴに関して
• M-Q4. 蛍光標識オリゴの取り扱い方法
• M-Q5. 修飾基とDNAを繋げているリンカーの長さを教えてください。
• M-Q6. FAM, Flourescein, FITCに違いについて教えてください
• M-Q7. Dideoxy法または関連方法に用意されている修飾を教えてください
• M-Q8. カスタムDNA、RNA製品の5’-位はリン酸残基が付いていますか？
• M-Q9. Biotin標識の形式と標識化率について教えてください。
• M-Q10. Webやカタログに載っていない特殊な製品も注文できますか？
• M-Q11. Q-dotの標識は可能ですか？
• M-Q12. 蛍光標識の方法と種類について

＜配送＞

• D-Q1. 配送状況を確認したいのですが？
• D-Q2. 研究室まで配送してほしいのですが？
• D-Q3. 配送は常温でしたが、保存はどうすればいいですか？
• D-Q4. 土・日・祝日に受け取りたいのですが？
• D-Q5. 配送希望日や受け取りが出来ない日がある場合はどうすればいいですか？
• D-Q6. 配送時間を指定できますか？

＜カスタムDNA全般＞

• Z-Q1. 分析書（Certificate of Analysis）について
• Z-Q2. 分析書に書かれたモル吸光度係数などを求める計算式を教えてください。
• Z-Q3. 2種類のTm値の記載が試験成績書にあるのですが、どちらのTm値を採用すれば良いのですか？
• Z-Q4. 出荷形態についてはどのような種類がありますか？
• Z-Q5. 注文した合成DNAを溶解する溶液について教えてください。
• Z-Q6. 濃度調製の仕方がわかりません。
• Z-Q7. 届いたカスタムDNAはどれ位保存できますか？
• Z-Q8. PCR用プライマーの設計のためのガイドラインを教えてください。
• Z-Q9. PCRプライマーのアニーリング温度についてアドバイスをいただけませんか？
• Z-Q10. 品質検査はどのように行っていますか？
• Z-Q11. 実験がうまくいかないのですが？
• Z-Q12. アニーリングサービスは行っておりますか？
• Z-Q13. 再合成になり遅延するとの連絡を受けました。理由を説明してください！
• Z-Q14. 再合成されて届いた製品の収量が、先に届いた同等品の収量と大きな差があるのですが？
• Z-Q15. 受け取ったプライマーが着色していました。不良品ですか？？

S-Q1. カスタムDNA（合成DNA）はどのように合成されますか？

当社のカスタムDNA合成はβ-Cyanoethyl Phoshoramidite法により合成されています。
この方法は過去30年間に渡り最も信頼の置ける合成法で、当社の行程では塩基の縮合収率は99%以上と高効率で目的鎖長のものを得ることができます。
当社の合成行程は目的鎖長まで一塩基ずつ縮合するStepwise合成です。
この方法では目的鎖長までに余分な塩基が挿入されることが無く、また、未反応の不完全長オリゴヌクレオチドもキャッピング(capping)という処理を施され、次の工程で塩基の延長ができないように処理されます。
これらの工程により、塩基挿入や塩基欠損のものの混入がない目的のオリゴヌクレオチドを提供することが可能となります。

合成工程図

1. Deblocking

固相担体上にあるヌクレオシドの5'-末端のジメトキシトリチル(DMTr)基を酸処理で脱離させ、5'-水酸基遊離の状態にします。脱保護されたジメトキシトリチル基はジメトキシトリチルカチオンとなり、このカチオンをモニターすることで合成の良否を判断します。

2. Coupling

遊離の5'-末端水酸基にNucleoside-3'-phosphoramidite unitを縮合します。

3. Capping

未反応の5'-末端水酸基をアセチル化することにより保護（キャップ化）をします。
アセチル基は塩基性条件下でのみ脱離しますので、次回以降の合成サイクルでは酸処理においてアセチル基は脱離せず、このキャッピング化されたDNA鎖は伸張しません。

4. Oxidation

三価のリン酸結合を安定な五価の正リン酸結合にします。

5. Deblocking

伸張したDNAの5'-末端からDMTr基を除去します。

このサイクルを繰り返すことにより目的鎖長までDNA鎖を伸張します。

S-Q2. 合成効率とは何ですか？

合成効率はDNA合成機のCPG担体上で、伸張するDNA鎖に新たな塩基を付加する効率を示す値です。
当社で採用しておりますβ-Cyanoethyl phosphoramidite法は、効率が良く縮合収率は光学的定量法で測定をすると100%~98%となりますが、一般に化学反応で収率が100%となる反応はごく稀であり、この点を考慮すると実際の合成効率は99%が上限となります。
このため、各縮合段階において、1%の未反応物が産生することになり、不完全鎖長DNAが合成物に含まれる要因となります。
合成の際に不完全鎖長DNAの産生を如何にして抑えるか、精製操作により不完全鎖長DNAを除去するかが課題となります。

S-Q3. 合成効率とはそんなに重要なのですか？

表に合成効率が99%の場合と98%の場合を示しました。
初期の段階では最終鎖長DNAの理論的収率の差は僅かですが、鎖長が長くなるに従い理論的収率に大きな差が認められます。
最終産物量を多く得るために合成効率の管理が重要となります。

S-Q4. どれ位の量が得られますか？

カスタムDNAの鎖長と収量の相関関係を示しました。
条件は50 nmoleスケール合成/脱塩精製で、合成効率98%、回収率100%、GC含量50%を想定しています。

カスタムDNAの鎖長と収量

S-Q5. どれくらいの長さのDNAまで注文できますか？

一般に合成効率の安定性は合成スタート時の合成スケールと関係があり、目的鎖長の上限により合成スケールの変更が必要な場合が生じます。上限の目安としては、100merまでとなります。

101mer 以上の合成も下記の条件でのみ受注可能です。

• 101mer以上150merまで
• 合成スケール 200nmol、脱塩、非修飾のみ

Ｗeb注文には対応しておりませんのでご注文はメールにて承ります。

S-Q6. PCRアプリケーション用の合成スケールについて教えてください。

PCRアプリケーション用のカスタムDNAをご注文する際には、合成スケールにより提供される反応数が決まります。以下の表ではPCR反応スケール100 μL、最終オリゴ濃度0.1～0.5 μMと仮定しています。

PCRアプリケーション用のオリゴ合成スケール

P-Q1. なぜ、精製は必要なのですか？

合成後の産物には不完全鎖長DNAがある割合で混入しています。
この不完全鎖長DNAが競合する場合があるので、用途によりましては精製操作により不完全鎖長DNAを除去する必要があります。

P-Q2. 精製には具体的にはどのような種類がありますか?

使用する用途、目的により実験に用いるカスタムDNAの純度は異なってきます。当社では4種の精製グレードを取り揃えています。

脱塩精製
多くのアプリケーションで使用可能な汎用性の高い精製グレードです。

カートリッジ精製
脱塩精製では除去が出来ていない不完全鎖長DNAを逆相クロマトグラフィーカートリッジで簡易精製する方法です。

HPLC精製
HPLC精製は紫外吸光でモニタリングを行いながら、精密にクロマトグラフィーで精製する方法です。カートリッジ精製では分離が難しい溶出特性が近似した微量混合物（不完全鎖長DNAなど）の除去が可能です。溶出プログラムは完全長DNAを分離するために最適化されたものを用い、高純度のカスタムDNAを提供します。

PAGE精製
HPLC精製は鎖長が65mer以下では純度が高く、また高収率で目的とする鎖長のDNAを分取することが可能ですが、長鎖になると分解能が低下し不完全鎖長DNAの分離が困難となってきます。66mer以上の高純度DNA精製にはPAGE精製をお薦めします。(PAGE精製は海外品となります。)

精製ガイド

P-Q3. HPLC精製時のチャートについて

複数の機種を使用しているため、HPLCチャートのフォーマットが使用した機種により異なります。
各機種において同一条件で精製を実施していますが、機種により検出時間が異なる場合があります。

M-Q1. WebやカタログにCy™5やCy™3などの蛍光標識サービスが見当たりません。

Cy系色素と同じ目的のアプリケーションに使用可能な下記の蛍光標識をご用意しています。

【光学特性】
＜Alexa™647 / Alexa555＞　 Cy5/Cy3と類似（近接）。安定性が高い。

詳細情報は、「価格表」や「修飾DNAと標識DNA（波長情報）」をご参照ください。

M-Q2. TaqMan Probeは受注しないのですか? また、Dark Quencher®は取り扱わないのですか？

TaqMan Probeは当社Applied Biosystems® カスタム プライマー&TaqMan® プローブにて受注をしています。 弊社はDark Quencher®、Blackhole Quencher®のライセンス許諾は受けておりません。また、TaqMan® Probeにおきましては過去から現在に至るApplied Biosystems®で販売されましたReal-Time PCR機器にOptimizeされており、安定した結果を提供します。

M-Q10. Webやカタログに載っていない特殊な製品も注文できますか？

Webやカタログにない修飾品についてもご提供できる場合もございますので、お気軽にご相談ください。ミックス塩基やS-オリゴ（Phosphorothioate）の合成も承っております。下記をご参照の上ご注文ください。

IUB code

M-Q11.Q-dotの標識は可能ですか？

当社ではカスタムDNAへのQ-dotの標識サービスは行っておりません。

M-Q12.蛍光標識の方法と種類について

一般に核酸誘導体の蛍光標識にはPhosphoramidite法によるものとアミノ標識核酸にN-Hydroxy Succinimidyl誘導体を用いて標識を行います。

＜Phosphoramidite 法＞

標識効率が高く、精製グレードも脱塩から選択可能。

＜ N-Hydroxy Succinimidyl誘導体を用いる標識法＞

Phosphoramidite 法を用いる標識法と比較して標識効率が低く、反応後に未標識DNAを除くためにHPLC精製などの高度な精製が必要。

N-Hydroxy Succinimidyl誘導体を用いる標識ではアミノ誘導体に反応させるので異なるN-Hydroxy Succinimidyl誘導体を同一の核酸誘導体に標識させることはできません。（例：1本のオリゴDNAにAlexa Flour 647とAlexa Flour 555の標識など）
Phosphoramidite誘導体（例：FAM、HEX、TET、Fluoresceinなど）とN-Hydroxy Succinimidyl誘導体を用いる場合は、標識が可能です。
なお、蛍光標識後のDNAは有機溶解性が高くなるため、同一の核酸誘導体に複数の標識を行うと精製が困難となる傾向があります。

Z-Q1. 分析書（Certificate of Analysis）について

分析表の見方例

Z-Q2.分析書に書かれたモル吸光度係数などを求める計算式を教えてください。

一般に合成DNAは、分光光度計などを用いて吸光度より定量を行います。合成DNAのモル吸光度（E260）とモル濃度、Tm値などの物性値は以下の式により求めることができます。

合成DNAのモル吸光度係数
E260 = (A x 15.3)+(C x 7.4)+(G x 11.8)+(T x 9.3)+(U x 10.1)+(I x 12.25)+(N x 10.95)+(B x 9.5)+(D x 12.1)+(H x 10.7)
+(K x 10.6)+(M x 11.4)+(R x 13.6)+(S x 9.6)+(V x 11.5)+(W x 12.3)+(X x 11.0)+(Y x 8.35)

合成DNAの分子量
Mw =[{(A x 313.2)+(C x 289.2)+(G x 329.2)+(T x 304.2)+(U x 290.2)+(I x 315)+(N x 309)+(B x307.5) +(D x 315.5)+(H x 302.2)+(K x 316.7)+(M x 301.2)+(R x 321.2)+(S x 309.2)+(V x 310.5)+(W x 308.7)+(X x 309.0)
+(Yx 296.7)} - 62]+1

GC%
%GC =[G+C+S+0.5(N+X+M+Y+K+R)+0.67(B+V)+0.33(H+D)]/ Total Number of Bases

1OD当たりの量
 g/ O.D.= Mw/ E₂₆₀

Z-Q3.　2種類のTm値の記載が試験成績書にあるのですが、どちらのTm値を採用すれば良いのですか？

2種類のTm値はアプリケーションに応じて使い分けください。アニーリングにはTm（1M Na+）の値をご参考ください。PCRにはTm (50mM Na+)の値をご参考ください。

Tm値の算出方法として、Nearest Neighbor法、Wallace法、GC%法などいくつか知られていますが、算出結果は方法により異なります。試験成績書に記載の各Tm値の計算式は下記になります。

(1) 10 bases 以上の場合
基本式：
Tm (Salt concentration) (> 10 bases)=81.5+16.6(Log [Molar Na+]+41(%GC)-675/ DNA Length
塩濃度が1 M (Annealing) の場合：
Tm (1M Salt Solution for Annealing) (> 10 bases)= 81.5+41(%GC)-[675/ DNA Length]
塩濃度が 0.05 M (PCR) の場合:
Tm (0.05M Salt Solution for Annealing) (> 10 bases)= 59.9+41(%GC)-[675/ DNA Length]

(2) 10 bases 以下の場合：
Tm(≦10 bases)= [{%GC x all bases} x4]-[{(1.00-%GC)x DNA Lengthx2}
（E260：DNA鎖のモル吸光度係数；Mw：DNA鎖の分子量；%GC： GC含量；Tm: Tm値）
ホルムアミド含有Bufferを使用する場合は式より65x(%form amide)を差し引いて補正してください。

Tm値とは二本鎖DNA分子の50%が解離して一本鎖DNAになる温度のことで、Primerの塩基配列、塩濃度、Buffer組成など様々な実験条件に依存して変化します。PCRを行う際、Tm値を元にアニーリング温度を決めますが、各Primerに最適なアニーリング温度を決めるためには、いくつか条件検討が必要です。Tm値の計算方法にもよりますが、一般的にはTm値±5℃程度の範囲で条件検討を行って頂くのが適当です。

Z-Q4．出荷形態についてはどのような種類がありますか？

当社では、乾燥品または液体品^*1で出荷しています。容器の指定^*2、濃度^*3や溶解する溶液^*4の指定等がございましたら、ご注文の際にお申し付けください。

^*1: 通常、10mM TE Buffer (pH 8)に溶解しています。
^*2: 2mLチューブまたは96穴ディープウェルプレートの2種の容器をご用意していますが、お客様ご指定の容器による出荷も可能ですのでご相談ください。
^*3: 濃度は100μM　(50 nmoleスケール)、500μM　(200nmoleスケール)、2500μM　(1μmoleスケール)となります。ご希望の濃度にも調製が可能ですのでご相談ください。（別途、調製料金が必要となります。）
^*4: TE bufferの他にH₂Oにも対応が可能ですのでご相談ください。

Z-Q5. 注文した合成DNAを溶解する溶液について教えてください。

合成DNAをTE［10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM EDTA］に溶解します。水のpHは多くの場合弱酸性で、合成DNAの加水分解を引き起こす可能性があるため、脱イオン水よりもTEに溶解することが推奨されます。
H₂Oによる溶解をご希望された場合には、Thermo Fisher Scientific 社の超純水製造装置GenPureを用いて作られた超純水（DNase/RNase フリー）を使用して溶解いたします。

Z-Q6. 濃度調製の仕方がわかりません。

液体でご注文されている場合には、すでに調整済みです。ご注文スケールによって濃度が異なりますが、下記のように調整されています。

合成スケールと液体調整濃度

乾燥品につきましては添付のカスタムプライマー使用説明書 の溶解例をご参照ください。
こちらには1 mM（1 nmole/μL）と100 μM（100 pmole/μL）への調整方法例が記されています。

Z-Q7. 届いたカスタムDNAはどれ位保存できますか？

カスタムDNAの保存期間の指標として下記の表を参考にしてください。特に蛍光標識されたものは繰り返しの凍結融解を避けて必要に応じて凍結前に分注することをお奨めします。乾燥品のカスタムDNAは-20℃で1年間安定です。TEに溶解したカスタムDNAは-20℃または4℃で一週間程度安定です。凍結下のカスタムDNAはヌクレアーゼの非存在下であれば、-20℃で6ヵ月間以上安定です。リン酸の加水分解を避けるため、必ず中性の水をご使用ください。水に溶解したカスタムDNAを4℃で保存しないでください。

カスタムDNAの保存期間

Z-Q8. PCR用プライマーの設計のためのガイドラインを教えてください。

理想的なPCRプライマー対は、ターゲット配列にまたがる固有配列にアニーリングし、サンプル中の他の配列にはアニーリングしません。プライマーの設計が悪ければ、ターゲット以外の配列が増幅される可能性があります。以下のガイドラインでは、望ましいプライマー配列の特徴について述べています。

• プライマー長は18～24塩基のヌクレオチドが一般的です。
• プライマーのGC含量は40～60%とするか、テンプレートのGC含量を反映させてください。
• プライマー対の3'末端が相補配列とならないようにしてください。
• 3'末端がGCリッチとならないようにしてください。
• プライマーの5'末端および中央にGまたはC残基が存在するように設計してください。
• 3'末端でのターゲットとのミスマッチは避けてください。
• 内部で二次構造を形成する可能性のある配列は避けてください。

Z-Q9. PCRプライマーのアニーリング温度についてアドバイスをいただけませんか？

融解温度Tmはプライマーにとって重要なパラメータです。これは、プライマーおよびその相補配列の50%が二本鎖DNA分子として存在する温度です。Tmは、PCRのアニーリング温度を決定するために必要です。アニーリング温度は55～70℃が妥当です。一般に、アニーリング温度はプライマーのTmよりも約5℃低く設定します。大部分の合成プライマーにはTm推定値が記載されているため、アニーリング温度は単なる出発点に過ぎません。アニーリング温度をさらに高くして行った複数の反応を解析することにより、PCRの特異性を向上させることができます。

Z-Q10. 品質検査はどのように行っていますか？

合成工程では全製品の工程をモニターすることにより管理をしています。また、合成・精製工程を終了後、LC-MS による品質の検定を行いプライマーの完全鎖長の確認を行っています。

Z-Q14. 再合成されて届いた製品の収量が、先に届いた同等品の収量と大きな差があるのですが？

再合成に使用するDNA/RNA合成機に依存して合成スケールが変更されることがあります。そのため収量に違いが出ることがあります。製品品質に影響はございません。