ウェスタンブロットにおけるタンパク質転写

ウェット、セミドライ、ドライの各方式の転写メソッドの比較

タンパク質をゲルからブロッティングメンブレンへ効率的かつ高い信頼性で転写することは、ウェスタン検出試験を成功させるための基礎になります。結果の精度は、ウェスタンブロッティング法の転写効率に左右されます。従来のウェット転写は高効率ですが、時間と労力がかかります。セミドライブロッティングは利便性が高く、時間的な節約もでき、各種タイプのバッファーシステムおよびバッファーフリーの事前組立済みスタックを使用できる柔軟性も有しています。しかしセミドライ転写では、分子量が大きなタンパク質（>300 kDa）の転写効率が低下する可能性があります。ドライ電気ブロッティングでは、高速かつ高品質な転写を実現でき、またバッファーを追加する必要がないことによる利便性も得られます。

SDS-PAGEまたはネイティブゲルからニトロセルロース、PVDF、ナイロンメンブレンにタンパク質を転写する主要な3つの方法：

• ウェットタンク電気転写
• セミドライ電気転写
• ドライ電気転写

ウェット式転写を行う場合は、最初にゲルを転写バッファーで平衡化します。次にゲルを“転写サンドイッチ”（フィルターペーパー-ゲル-メンブレン-フィルターペーパー）の状態に配置し、パッドを緩衝剤としてサポートグリッドで一緒にプレスします。サポートされたゲルサンドイッチを、タンク内にあるステンレススチール／白金ワイヤー電極の間に垂直に配置し、タンクに転写バッファーを充填します。

標準的な電界オプションで複数のゲルを電気転写できます。このオプションでは、一定の電流（0.1～1 A）または電圧（5～30 V）を用いて最短1時間から一晩をかけて処理をします。転写は通常、発生する熱を軽減するために氷パックを使用して4℃で行います。単一ゲル用の高電界オプションでは、転写時間を最短30分にまで短縮できますが、高電圧（最大200 V）または高電流（最大1.6 A）を必要とし、発生する多大な熱を消散させるための冷却システムも必要になります。

14～116 kDaのタンパク質で80～100%の転写効率を達成できます。転写時間を長くすることで転写効率を向上できます。ただし時間が長くなると、タンパク質がメンブレンを通過してしまう過剰転写（ブロースルー）のリスクが生じることになり、特に孔径が大きい（0.45 µm）メンブレン使用時には低分子量（<30 kDa）タンパク質で危険性が顕著です。

セミドライ式タンパク質転写では、転写サンドイッチがセミドライ転写装置内の2つのプレート電極の間に水平に配置されます。こうしたセミドライ転写では、ゲルを転写バッファーで事前に平衡化することが非常に重要です。最大限の電流をゲルの周囲ではなく内部を通過させるため、転写に用いるバッファーの量は、転写サンドイッチにちょうど浸み込む量に調整します。極厚のペーパー（厚さ約3 mm）とメンブレンをバッファーに十分に浸しておくことも有効です。同様に、フィルターペーパーシートとメンブレンを、ゲルのサイズにカットすることも重要です。

1～4枚のゲルをメンブレンに迅速に電気ブロットできます。転写バッファーにはメタノールが含まれている場合もありますが、セミドライブロッターの損傷を避けるため、芳香族炭化水素、塩素化炭化水素、アセトンなど、その他の有機溶剤は使用しないでください。電気転写は、一定の電流（0.1～0.4 A）または電圧（10～25 V）で、10～60分間行います。転写時間の短縮の観点からはメタノール非含有の転写バッファーが推奨され、転写時間を7～10分に短縮できます。14～116 kDaのタンパク質に対して60～80%の転写効率が達成可能ですが、分子量の高いタンパク質ほど転写により長時間を必要とします。

ドライ電気ブロッティング法では、従来の転写バッファーを使用しない革新的なコンポーネントを含んだ特殊な転写サンドイッチを使用します。バッファータンクや湿潤済みフィルターペーパーの代わりに、バッファーを組み込んだ独自のゲルマトリックス（転写スタック）を使用します。ゲルマトリックス中の高いイオン密度により、迅速なタンパク質転写が可能です。ブロッティング中、銅製の陽極は水の電気分解による酸素ガスを生成しないため、ブロットの歪みが低減されます。ウェット式およびセミドライ式などの従来のタンパク質転写テクニックでは、酸素を生成する不活性電極を使用しています。短い電極間距離、強い電界強度、および高電流により、転写時間は通常は短縮されます。