Chlamydomonas タンパク質発現キット

キットは凍結Chlamydomonas reinhardtii 137c細胞に加え、藻類、発現ベクター、OneShot® TOP10 Competent E. coli細胞に用いるMAX Efficiency® Transformation Reagentと分かりやすいプロトコル が入っています。別途に販売されているGibco® TAP Growth Mediaは、Chlamydomonasの増殖および増殖維持のために最適化した培地です。

• Express up to 1% total soluble protein of your gene of interest
• Select against gene silencing, even over multiple passages
• Detect and purify your gene of interest with 6His TEV and/or V5-His epitope tags
• Use (optional) seamless assembly to create your constructs
• Enables reliable results with exceptional strain viability and purity

pChlamy_4ベクターを介したChlamydomonasの核ゲノムからの遺伝子導入・発現は、翻訳後修飾、タンパク質のタ—ゲッティングおよび／または分泌など、葉緑体タンパク質合成においてメリットがいくつもあります。

• 内在的・構成的プロモーターRbcS2は、アクチベーター(Hsp70A)と組み合わせて使用することにより、お客様の目的遺伝子発現量を増加させます。
• Fusion of your gene of interest to bleomycin/zeocin resistance gene, sh-ble, circumvents silencing
• Self-cleaving sequence for the 2A peptide from foot-and-mouth disease virus (FMDV) mediates proper cleavage between resistance markers and protein of interest to yield two discrete proteins
• 3’ UTR for proper transcript termination and possible additional benefits like increased translation efficiency, mRNA stability, and polyadenylation signals
• Dual protein tags 6His TEV and V5-His epitopes can be fused to both or either ends of your gene of interest, or you can elect to have no tag at all
• Use (optional) seamless assembly to create your constructs

Trichoderma reesei由来のキシラン加水分解酵素キシラナーゼ (xyn1) の遺伝子をpChlamy_4ベクターに挿入してクローン化し、Chlamydomonas reinhardtii 137cに形質転換しました。次に EnzChek® Ultra Xylanase Assay Kit (Cat. No. E33650)を用いてキシラナーゼ活性を測定しました。pChlamy_4コンストラクト（'Prot Exp'）でみられたキシラナーゼ活性レベルは、ライフテクノロジーズの第一世代GeneArt® Algae Engineering Kit系（'Genetic Eng'）でみられたキシラナーゼ活性の17倍でした。

Trichoderma reesei由来のキシラン加水分解酵素キシラナーゼ (xyn1) の遺伝子をpChlamy_4ベクターに挿入してクローン化し、Chlamydomonas reinhardtii 137cに形質転換しました。キシラナーゼタンパク質発現量をウエスタンブロット法で測定した結果、キシラナーゼタンパク質は、可溶性タンパク質の総量の約1％でした。

 Chlamydomonas reinhardtiiでよくみられる導入遺伝子のサイレンシング を回避するため、新たなpChlamy_4ベクターをデザインし、ブレオマイシン／ゼオシン耐性遺伝子sh-bleと融合させるとタンパク質が転写因子として発現するようにしました。口蹄疫ウイルス（FMDV）由来の2A自己切断ペプチドを抗体耐性遺伝子と目的遺伝子の間に挿入します。このペプチドは、20以下の短いアミノ酸配列をコードし、適切に切断することによりタンパク質を2つに分割します。本発現系を用いたところ、形質転換した細胞は、淘汰圧の有無にかかわらず、細胞を何度も経代した後ですらも、他の発現系よりもはるかに長時間タンパク質を大量発現しました（下図を参照）。

Trichoderma reesei由来のキシラン加水分解酵素キシラナーゼ (xyn1) の遺伝子をpChlamy_4ベクターに挿入してクローン化し、Chlamydomonas reinhardtii 137cに形質転換しました。次に EnzChek® Ultra Xylanase Assay Kit (Cat. No. E33650)を用いてキシラナーゼ活性を2週間毎日測定し、この遺伝子を、他の発現系で発現させた時の発現レベルと比較しました。pChlamy_4ベクターでキシラナーゼ遺伝子をブレオマイシン／ゼオシン耐性遺伝子sh-bleと融合させるとサイレンシングを回避することができるため、淘汰圧の有無にかかわらず、細胞を何度経代してもタンパク質を発現します。

Chlamydomonas は外来性DNAのChlamydomonas への導入が研究開発において最も大きな障害の一つとなっていました。ガラスビーズ法、エレクトロポレーション（電気穿孔）法、微粒子銃などの方法もありますが、しばしば形質転換効率が下がります。MAX Efficiency® Transformation Reagent for Algaeをエレクトロポレーション前の細胞の前処理に用いると、多くのChlamydomonasの形質転換効率が上がります。MAX Efficiency® Transformation Reagent for Algaeは、エレクトロポレーション法を用いることにより、Chlamydomonas細胞壁透過率を上げ、DNAを導入しやすくします。ライフテクノロジーズがこれまでに推奨している条件で環状DNA、直鎖DNAおよびPCRフラグメントを用いた形質転換を行った結果、野生型および突然変異型を含めた10種類のChlamydomonas株において、形質転換効率が200倍以上に上がりました。