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サンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法（ELISAs）は、捕捉抗体を固相担体へ吸着させるものです。その後、未知量の標的タンパク質または目的の分析物を含むサンプルを添加し、捕捉抗体に結合します。洗浄ステップでマイクロプレートの未結合物質を取り除いた後、HRPコンジュゲートを検出用に添加します。
ELISA法は抗原の定量化におけるベンチマークです。結果が迅速で一貫性があり分析も比較的容易なため、ELISAはハイスループットのスクリーニングに適用可能です。精製度の高い、プレマッチキャプチャーおよび検出抗体を利用して、最良の結果がサンドイッチ方式で得られました。生じたシグナルにより高感度で特異性の高いデータが得られます。すぐに使用できるELISAキットは市販されており、一般に研究された何百ものタンパク質および他の生体分子に利用できます。 Thermo Scientific™ Pierce™ ELISA Kitsの詳細は Find ELISA Kits by Target を参照下さい。
ELISAプロトコル（図1）はマイクロプレートのウェル上にコーティングされた目的のタンパク質に特異的な捕捉抗体で始まります。目的のタンパク質を含有するスタンダードを含むサンプル、コントロール試料および未知の試料がこれらのウェルにピペットされます。最初のインキュベーションの間、タンパク質抗原は捕捉抗体に結合します。洗浄後、検出抗体をウェルに添加し、この抗体を最初のインキュベーションの間に捕捉された固定化タンパク質に結合させます。過剰な検出抗体を除去した後、HRPコンジュゲート（二次抗体またはストレプトアビジン）を添加し、検出抗体に結合させます。3回目のインキュベーションおよび洗浄による過剰なHRPコンジュゲートの除去後、基質溶液を加え、酵素によって検出可能な形態（カラーシグナル）に変換します。この着色生成物の濃さは、最初の試料中に存在する抗原の濃度に比例しています。
図 1。典型的なサンドイッチELISAプロトコルの一般スキーム。
注：ここに示されたサンドイッチELISAプロトコルは、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、および他の細胞外標的の測定用の 多くのReady-to-use ELISAキットを表しています。 目的タンパク質、抗体、バッファー、または使用する基質に応じて、この一般プロトコルの最適化を必要とする場合があります。 詳細は Overview of ELISA および ELISA Development and Optimizationをご参照下さい。
典型的なELISAキットコンポーネント
- 抗体コート96ウェルマイクロプレート
- 検出抗体（通常、ビオチン化）
- 標準
- HRP コンジュゲート（抗体またはストレプトアビジン）
- 希釈バッファー
- 洗浄バッファー
- 発色基質（通常TMB）
- 停止液
- プレートカバー
必要な追加材料
- 吸光度ベースのマイクロプレートリーダー
- 蒸留水または脱イオン水
- 洗浄ボトルや自動96ウェルプレートウォッシャー
- サンプル (ELISA サンプル調製プロトコルを参照)
実行時間: 44時間～30分ハンズオンタイム
注: 定量化のために標準曲線を各アッセイで実行する必要があります
- すべての試薬を使用前に室温にします。使用前にすべての液体試薬を穏やかに混合します。
- 50～100μLの調製済み標準とサンプルをウェルに添加します。プレートをカバーし、室温で2時間インキュベートします。
- 溶液をウェルから完全に吸引またはデカントし、液を捨てます。
- 洗浄ボトルや自動96ウェルプレートウォッシャーを用いてウェルを4回洗浄します。
- 100μLの希釈した検出抗体をウェルに添加します。プレートをカバーし、室温で1時間インキュベートします。
- 溶液をウェルから完全に吸引またはデカントし、液を捨てます。
- ウェルを4回洗浄します。
- 各ウェルに100μLの希釈したHRPコンジュゲートを添加します。プレートをカバーし、室温で30分間インキュベートします。
- 溶液をウェルから完全に吸引またはデカントし、液を捨てます。
- ウェルを4回洗浄します。
- 各ウェルに100μLの発色基質を添加します。
- 暗所で30分間、室温でプレートを現像します。
- 各ウェルに100μLの停止液を添加します。ウェル中の溶液が青から黄色に変わります。
- 反応停止から30分以内にプレートを評価する必要があります。450 nmおよび550 nmで各ウェルの吸光度を解読します。マイクロプレート内の光学誤差を補正するために、450nmの値から550 nmの値を引きます。
- 曲線適合統計ソフトを使用して、4パラメータロジスティック曲線を標準に適合するようプロットし、テストサンプルの結果を集計します。
注: Thermo Scientific™ Pierce™ Antibody Pair Kitを使用の場合、捕捉抗体を96ウェルマイクロプレート上にご自身でコートする必要があります。 このプロセスには、96ウェルマイクロプレート、捕捉抗体およびブロッキングバッファー（通常、BSAまたはPBSで希釈したミルク）が必要です。 上記のプロトコルを開始する前に、次のステップを実行下さい：
- すべての試薬を使用前に室温にします。 使用前にすべての液体試薬を穏やかに混合します。
- 各ウェルに100μLの希釈した捕捉抗体を添加します。 プレートをカバーし、4°Cで一晩インキュベートします。
- プレートを室温に戻します。 溶液をウェルから完全に吸引またはデカントし、液を捨てます。
- ウェルを4回洗浄します。
- 各ウェルに200μLのブロッキングバッファーを添加します。 プレートをカバーし、室温で1時間インキュベートします。
- 溶液をウェルから完全に吸引またはデカントし、液を捨てます。
--上記のプロトコルを続けます--