Countess 자동 세포 카운터 샘플 데이터

머신 학습 알고리즘은 뭉친 세포와 샘플 잔해물로 정확한 카운팅을 수행합니다. 

크기가 작고 응집을 형성하기 쉬운 RAW(mouse macrophage)를 카운팅하기 위해 Countess 3 FL 자동 세포 카운터를 brightfield 모드에서 사용했습니다. viability를 설정하기 위해 트리판 블루 염색을 사용했습니다. 이 그림은 원시 영상(왼쪽)과 향상된 영상(오른쪽)을 모두 보여 주며, 이 영상에는 살아있는 세포가 녹색 윤곽선으로 표시되고 사멸 세포는 빨간색 윤곽선으로 표시됩니다. 카운팅 알고리즘은 군집의 세포를 확실하게 인지하여 적절히 분할하고 세포 개수를 카운팅 할 수 있습니다. 잔해물이 인식되었고 자동으로 카운팅에서 제외되었습니다.

Brightfield 및 형광 모드에서 murine PBMC의 viability. 

Countess 3 및 Countess 3 FL 자동 세포 카운터는 brightfield 및 형광 모드에서 사용하여 5µm 정도로 크기가 작은 murine PBMC를 카운팅 하였습니다. brightfield 카운팅(왼쪽)에서 트리판 블루 염색(0.4%)을 사용하여 viability를 구분했습니다. Countess 3 세포 카운터는 녹색 윤곽선(원)으로 살아 있는(반투명) 세포를, 빨간색 윤곽선으로 사멸 세포(심층 염색)를 표시하여  viability를 나타냅니다. 

형광 모드(오른쪽)에서 acridine orange/ propidium iodide (AO/PI) 분석 결과는 보다 높은 생존/사멸 특이도를 나타냅니다. AO는 핵을 가진 모든 살아 있는 세포를 녹색으로 염색하고 EVOS GFP 2.0 라이트 큐브를 사용하여 검출할 수 있으며, PI에 의해 사멸 세포는 빨간색으로 염색되고 EVOS Texas Red 2.0 라이트 큐브를 사용해 검출할 수 있습니다. 이는 형광 염색이 트리판 블루에 비해 더 정확한 viability를 얻을 수 있음을 보여주는 사례입니다.

형광 모드에서 Apoptotic 세포와 죽은 세포 검출. 

2 및 4µm staurosporine과 함께 배양한 후 USO2(human osteosarcoma epithelial) 세포는 apoptotic 세포를 식별하기 위해 1:400 CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent로 라벨링한 다음, 1:1,000 SYTOX Red Dead Cell Stain으로 염색하여 모든 죽은 세포를 표시합니다. 세포를 실온에서 30분 동안 배양하고 EVOS LED 라이트 큐브,  GFP 2.0 및 Cy5 2.0을 사용해 Countess 3 FL 자동 세포 카운터에서 카운팅을 실시했습니다. 녹색 및 적색 신호 모두 약물 투약량이 증가할 수록 높아졌으며, 이는 각각 apoptosis와 세포 사멸에서 상당한 증가를 의미합니다. 4µL staurosporine 퍼센트의 합계는 100% 이상이며, 두 가지 염색을 나타내는 세포가 16% 이고 이것이 세 개 카테고리 모두에서 카운팅되기 때문입니다.

scRNA-Seq 및 scATAC-Seq를 위한 단일 세포와 핵의 정확한 자동 카운팅. 

FL-기반 카운팅을 사용하는 Countess 3 FL 자동 세포 카운터의 핵 카운팅은 정확한 카운팅을 제공하며, 이는 염기서열분석을 통해 검증되었습니다. GM12878 세포주(A) 및 PBMC(B)에서 분리된 핵에 대한 FL-기반 카운팅이 BF-기반 또는 Countess II 기기보다 더 많은 핵을 카운팅했습니다. (C)뇌 조직에서 분리된 핵에 대한 카운팅에서 Cellaca™ MX 고처리량 자동 세포 카운터에 비해 FL-기반 카운팅이 더 정확한 카운팅을 제공했습니다. (D)차세대 염기서열분석(NGS)으로 FL-기반 카운팅에서 얻은 2,000개 표적 핵의 정확한 로딩을 확인했습니다. *FL-기반 카운팅은 소프트웨어 업데이트를 사용하여 Countess 3 FL 기기에서 이용 가능합니다. 10x Genomics R&D에 의해 얻은 데이터.

유세포분석과 자동 세포 카운팅에서 측정된 Transduction 효율 비교. 

Invitrogen CellLight Nucleus-GFP, BacMam 2.0를 사용하여 U2OS 세포가 transduction 되고 36 시간 동안 배양되었습니다. 이 세포를  (그래프, 왼쪽)유세포분석 및 (이미지, 오른쪽)GFP 라이트 큐브가 있는 Countess II FL 자동 세포 카운터를 통해 형광 단백질 발현을 평가했습니다. 두 가지 방법으로 transduction 퍼센트가 측정되었고 49.5% vs 49%로 거의 동일하게 나타났습니다.

CAR-T 세포 배양 품질 관리. 

CAR-T 세포는 Dynabeads Untouched Human T Cells Kit를 사용해 분리되고 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation을 사용해 활성화 되었습니다. Countess 3 FL 자동 세포 카운터에서 트리판 블루 염색과 함께  brightfield 카운팅을 사용해 증식 전후의 세포 배양을 모니터링했습니다. 이미지(왼쪽)과 히스토그램(오른쪽)에서 T 세포와 비드는 자동으로 구분되며, T 세포는 생존(녹색)으로 나타나고 비드는 사멸(빨간색)으로 나타납니다. 원하는 경우, 크기 및 강도를 기준으로 비드를 수동으로 게이팅할 수도 있습니다.

GFP 발현을 통해 측정한 렌티바이러스 transduction 효율성.

Cas9 단백질을 발현하는 U2OS 세포가 1및 2의 MOI(multiplicity of infection)에서  LentiArray CRISPR Positive Control Lentivirus, human HPRT, with GFP 및 음성 콘트롤 렌티바이러스(scramble, GFP)를 사용해 transduction 되었습니다. 이틀 후 GFP 발현을 위해 Countess II FL 세포 카운터에서 세포를 카운팅 했습니다. (왼쪽) Countess II FL 기기에서 대표 카운팅 결과를 표시합니다. (오른쪽) 막대 그래프는 GFP 양성인 세포의 비율을 보여주며 성공적인 transduction을 나타냅니다.