Attune 유세포분석기 샘플 데이터

염화암모늄 용해(lysis) 버퍼로 용해된 숙성된 인간 전혈(AllCells).  Cells_Half_Resolution_v22 모델을 사용하여 이미지를 처리했습니다. 표시된 통계값은 %게이팅입니다.

끈적끈적한 CEN 세포를 위한 정확한 게이팅

CEN 세포는 제조업체 지침(BD)에 따라 PI로 염색되었고 100 µL/min로 Attune CytPix 유체분석기에서 수집되었습니다. PI 히스토그램에서 게이트는 원래 각 피크의 양 측면에 어깨(shoulder)를 포함하도록 그려졌으며(CEN gating strategy 1, 상단 중심), 게이트 I에 단일 세포(singlet), 게이트 II Doublet 등이 포함될 것으로 예상했습니다. 그러나, 게이트 I 내에서 Doublet 이미지가 캡처되었습니다(왼쪽). 각 피크에 대해 오른쪽 어깨(shoulder)를 제외하기 위해 게이트 경계를 왼쪽으로 이동하여(CEN gating strategy 2, 오른쪽) 올바른 게이트 내에서 Singlet와 Aggregates를 모두 효과적으로 분류했습니다.

Ramos 세포 배양의 오염

배양 중인 Ramos(림프종) 세포는 융합된 것으로 보이지만, 일상적인 계대 품질 검사 중에 세포 수와 생존율이 감소하는 것으로 나타났습니다. 추가 평가 결과, Attune CytPix 유세포분석기(A,B)에서의 이미징과 백게이팅으로 미생물 오염이 확인되었습니다. 이 오염의 초기 징후(C)는 처음에는 Debris로 무시되었습니다.

PBMCs에서 rare ILC2 집단 검출

(A) 100 μL PBS(+10% FBS)에서 재현탁된 1 x 10⁶PBMC의 레이블링. 사용된 항체는 Invitrogen FITC, CD123-FITC 및 CRTH2-Alexa Fluor 647 conjugate에 결합된 CD2, CD3, CD14, CD16, CD19, CD56 및 CD235a를 포함하는 lineage cocktail이었습니다. 이어서 ILC2 세포는 Lineage (BL1)-음성, CRT2(RL1)-양성 집단으로 정의되었습니다. (B) Th2 세포에서 발현되는 화학유인물질 수용체-상동 분자를 발현하는 CRTH2 세포. CRTH2는 heterotrimeric G 단백질과 결합된 7-막투과 단백질입니다. CRTH2는 Prostaglandin D2 수용체로, Th2 세포, 호산구 및 호염기구에 의해 발현됩니다. CD294는 Th2 세포의 Apoptosis를 예방하고 천식 폐와 같은 알레르기 염증 부위에 CRTH2-발현 세포의 Chemotaxis를 매개합니다. (C) ILC2 세포는 계통(lineage)-음성 및 CRTH2-양성으로 정의됩니다. 이 예에서 ILC2 집단은 패어런트 게이트의 0.016%입니다. 데이터 제공: David Cousins, University of Leicester

림프종 세포를 표적으로 하는 CAR T 세포의 시각화

CAR T 세포와 Ramos 세포는 각각 CellTrace Far Red 및 CellTrace Violet으로 표지되어 37°C에서 1시간 동안 1:1 비율로 배양했습니다 200 µL/분, >8 x 10⁵ cells/mL에서 Attune CytPix 유세포분석기로 비여과 시료를 수집하였습니다. 사분면 Q1(왼쪽 위), Q4(오른쪽 아래) 및 Q3(왼쪽 아래)의 이미지는 각각 Ramos 세포, CAR T 세포 및 파편을 보여 줍니다. 사분면 Q2의 이미지(양쪽 염색에서 양성으로 나타남, 오른쪽 위)는 CAR T 세포가 Ramos 세포를 집어삼킬 때 단일 이벤트로 획득하여 두 유형의 세포가 함께 융합되는 것을 보여줍니다.

림프종 세포를 표적으로 하는 CAR T 세포의 시각화

CAR-T 세포와 Ramos 세포는 각각 CellTrace Far Red 및 Violet으로 표지되어 37°C에서 1시간 동안 1:1 비율로 배양했습니다. 여과되지 않은 샘플은 Attune CytPix Flow Cytometer에서 200 µL/분, >8 x 10⁵ cells/mL로 수집되었습니다. 사분면 Q1(왼쪽 위), Q3(오른쪽 아래) 및 Q4(왼쪽 아래)의 이미지는 각각 Ramos 세포, CAR T 세포 및 Debris을 보여 줍니다. 사분면 Q2의 이미지(양쪽 염색에서 양성으로 나타남, 오른쪽 위)는 CAR T 세포가 Ramos 세포를 집어삼킬 때 단일 이벤트로 획득하여 두 유형의 세포가 함께 융합되는 것을 보여줍니다. 백분율은 %게이팅입니다.

세포 이미지 갤러리에서 주석이 달린 이벤트는 중앙 위치를 나타내는 노란색 점과 함께 검은색 윤곽선으로 표시됩니다. 이미지 처리는 Cells Half Resolution 모델을 사용하여 원형도 대 강도 왜도 분석을 통해 실시하였습니다. 따라서 세포간 상호작용(CAR-T 세포와 Ramos 세포 사이)과 세포가 동일 시야 내에 있으나 세포간 상호작용이 일어나지 않는 분리 상태를 구분할 수 있습니다.

대장암 세포를 샘플당 1,000개의 비율로 건강한 인간 PBMC에 주입하였습니다. 모든 샘플은 암스테르담 UMC에서 준비했습니다. 표시된 통계값은 세포 개수입니다. Cells_Half_Resolution_v22 모델을 사용하여 이미지를 처리했습니다.

감염된 293T-ACE2 세포의 SARS-CoV-2 핵단백질 염색

(A) 미감염 세포 및 (B) 0.1 MOI에서 36시간 후 SARS-COV-2 감염된 293T-ACE2 세포. 세포는 표준 프로토콜을 사용하여 준비되었으며 SARS coronavirus nucleoprotein monoclonal antibody(clone 1C7C7) 및 PE에 콘주게이트된 anti-mouse secondary antibody(카탈로그 번호: P852)를 사용하여 염색되었습니다. 데이터는 autosampler가 장착된 Attune NxT 유세포분석기를 사용하여 수집되었습니다. 분석은 FCS Express 7에서 수행되었습니다.

심근세포 분화 중 전사 인자의 유세포 분석

심근세포 분화 중 H9 hPSC 세포에서 Oct4 및 Nkx2.5의 염색 프로파일을 나타내는 2-파라미터 플롯입니다. 모든 플롯은 단일 세포(singlet cell)에 대해 게이팅되었습니다. (A) 제 1일에 거의 모든 세포는 Oct4⁺ 및 Nkx2.5^–이며, 다능성 상태와 일치합니다. (B–J) 분화 과정 동안, 각 분화의 날짜에 대한 데이터가 표시되고 세포는 Oct4 발현을 상실하고 심장 마커 Nkx2.5를 발현하기 시작합니다. 우선순위 밀도 플롯은 Nkx2.5⁺ 세포를 나타내는 적색(red) 집단 및 Oct4⁺ 세포를 나타내는 녹색(green) 집단으로 표시되었습니다.

두 가지 E. coli CFU 유형의 차이

E. coli 세포를 밤새도록 37ºC에서 배양한 후 4ºC에서 3일간 배양했습니다. 100 µL/min으로 Attune CytPix 유세포분석기에서 시료를 수집하였습니다. 이미지에서 두 가지 유형의 CFU가 확인되었습니다. (A) 단일 세포와 유사한 짧은 콜로니와 (B) 불완전 분열 링을 가진 긴 구조. 각 집단의 대표 이미지를 표시하였습니다. 선택된 이미지에서의 백게이팅은 두 집단이 FSC vs SSC Dot plot(주황색 점, 왼쪽)에서 차이가 있음을 보여주었습니다.

데이터는 A. thaliana Col-1 잎 조직으로부터 준비된 식물 핵에서 수집되었으며 532 nm 레이저를 사용하여 FxCycle PI/RNase 염색 용액으로 레이블링되었습니다. (A)side scatter vs. FxCycle PI/RNase 형광의 2-파라미터 밀도 플롯,형광 핵을 둘러싼 scatter 게이트 사용. (B) 단일 핵에 대한 게이트를 위한 FxCycle PI/RNase 형광의 2-파라미터 밀도 플롯. (C) 핵 게이트된 집단의 FxCycle PI/RNase 형광에 대한 로그 히스토그램으로 2C, 4C, 8C 및 16C 핵에 상응하는 여러 개의 피크 표시.

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다수의 loci에서 단백질 녹다운(knockdown) 효율 검사

Human peripheral blood mononuclear cell(PBMCs)를 배양하고 이후에 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 kit를 사용하여 T세포를 활성화했습니다. 그런 다음 Invitrogen TrueGuide Synthetic gRNA, TrueCut Cas9 Protein v2 및 Invitrogen Neon 트랜스펙션 시스템을 이용해 세포를 편집했습니다. Invitrogen TrueDesign Genome Editor 도구를 사용하여 human T세포 수용체, Beta-2-Microglobulin 및 CD47 유전자를 타겟으로 하는 gRNA를 설계했습니다. 각 유전자좌에서 기능 단백질 녹다운에 의해 측정되었듯이, 유세포분석을 통해 트랜스펙션 72시간후 편집 효율에 대해 세포를 분석했습니다. 시료는 Attune NxT 유세포분석기와 CytKick Autosampler에서 실행되었습니다. 위의 오버레이 플롯은 Attune 유세포분석 소프트웨어에 의해 생성되었습니다. 각 히스토그램은 비-네온(non-neon) 대조물질로 오버레이되었습니다. 사용된 단클론 항체는 TCR alpha/beta (IP26) PE (eBioscience), Beta-2 Microglobulin (B2M-01) FITC 및 CD279 (PD-1) (eBioJ105(J105)) APC-eFluor 780 (eBioscience)이었습니다.

TCR alpha/beta, B2M 및 PD-1 loci에서 human PBMC 단백질 녹다운(knockdown)에 대한 유세포분석 오버레이 플롯

Human peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)를 배양하고 이후에 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 kit를 사용하여 T세포를 활성화했습니다. 그런 다음 Invitrogen TrueGuide Synthetic gRNA, TrueCut Cas9 Protein v2 및 Invitrogen Neon 트랜스펙션 시스템을 이용해 세포를 편집했습니다. Invitrogen TrueDesign Genome Editor 도구를 사용하여 human T세포 수용체, Beta-2-Microglobulin 및 CD47 유전자를 타겟으로 하는 gRNA를 설계했습니다. 유세포분석, 차세대 염기서열분석, Sanger 염기서열분석 및 genomic detection cleavage assay을 통해 트랜스펙션 72시간 후 편집 효율에 대해 세포를 분석했습니다. Attune NxT 소프트웨어가 모든 수치 및 데이터 분석에 사용되었습니다. 각 히스토그램은 네온이 처리되지 않은 대조물질로 오버레이되었고, 각 그림은 단일 웰에서 수집된 데이터입니다. 사용된 단클론 항체는 TCR alpha/beta (IP26) PE (eBioscience), Beta-2 Microglobulin (B2M-01) FITC 및 CD279 (PD-1) (eBioJ105(J105)) APC-eFluor 780 (eBioscience)이었습니다.

동일한 세포에서 발현되는 다수의 형광 단백질 검출

Invitrogen Lipofectamine 3000 시약을 사용하여 293FT세포를 두 개의 플라스미드를 이용하여 트랜스펙션하였습니다. 각 플라스미드를 별도로 순차적으로 전달(상단 패널)하거나 1:1(w/w) 믹스(하단 패널)를 사용하였습니다. 트랜스펙션된 세포는 유세포분석에 의한 수집 및 분석에 앞서 48시간 동안 증식되었습니다. 시료는 100μL/분의 유속으로 Attune NxT 유세포분석기를 사용하여 수집되었으며 각 시료에 대해 최소 15,000개의 이벤트가 수집되었습니다. 모든 주요 세포 집단이 검출되었습니다. 형광 단백질 중 하나를 발현하는 세포, 두 형광 단백질을 발현하는 세포, 그리고 두 형광 단백질 모두 발현하지 않는 세포(백분율은 플롯에 표시)가 검출되었습니다. 형광 단백질을 발현하는 세포는 비형광 단백질 발현 세포와 쉽게 구분됩니다. (A) TagBFP 및 mOrange2의 excitation을 위해 각각 405 nm 및 561 nm의 레이저를 사용했습니다. (B) TagBFP 및 mKate의 excitation을 위해 각각 405 nm 및 561 nm의 레이저를 사용했습니다. (C) emGFP 및 mKate의 excitation을 위해 각각 488 nm 및 561 nm의 레이저를 사용했습니다.

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