Attune 유세포분석기 특징

모든 Attune 유세포분석기의 공통적인 특징

Attune NxT 및 Attune CytPix 유세포분석기는 많은 동일한 특징을 공유합니다. Attune CytPix 유세포분석기는 Attune NxT와 동일한 하드웨어와 기능을 모두 가지고 있으며, 추가로 고속 brightfield 카메라와 자동 이미지 분석 소프트웨어가 있습니다. 아래에서는 감도 및 빠른 획득을 위한 acoustic focusing, 유연성 및 신뢰성을 위한 광학 설계, clogging 방지 유체공학 등의 두 기기의 공통적인 특징을 설명합니다. Attune CytPix의 이미징 및 이미지 분석 기능에 대해 알아보시려면 여기를 클릭하세요. 

 

연구 요구 사항에 맞는 시스템을 설계하기 위해 장비 구성 도구를 사용해보세요.

감도 높은 분석을 위한 Acoustic focusing

Attune 유세포 분석기는 의료 이미징에 사용되는 초음파와 hydrodynamic 힘을 결합하여 세포를 중앙 축에 하나의 집속된 라인으로 정밀하게 배치합니다. 레이저 조사 지점에 세포를 긴밀히 집중시킬 수 있어 시스템은 더 많은 광자를 수집할 수 있으므로 sample-to-sheath 비율에 상관없이 데이터 품질을 보장합니다.

Acoustic focusing

Acoustic focusing(왼쪽)은 높은 시료 속도에서도 세포를 정밀하게 위치시켜 신호 변동이 적고 데이터 품질이 우수합니다. 기존의 hydrodynamic focusing(오른쪽)은 높은 시료 속도에서 시료 스트림 코어를 확장하여 신호 변동과 데이터 품질 저하 결과를 가져옵니다.

“한마디로 말하자면, Acoustic Focusing 기술로 초당 35,000개의 세포를 분석할 수 있다는 면에서 [다른 것]보다 성능이 뛰어납니다. 100~1,000µL/분의 높은 유속에서 분석을 수행해도 정확도가 감소하지 않기 때문에 실험에 필요한 시간이 크게 단축됩니다.”

Dr. Takashi Satoh,

IFReC 조교수

일본 오사카 대학

Acoustic focusing은 Attune CytPix 기기의 세포 이미징에 유용하며, 세포의 위치를 정밀하게 조정하여 선명한 이미지를 얻을 수 있도록 도와줍니다.  동영상에서도 볼 수 있듯이 Acoustic focusing 없이 촬영한 세포는 흐릿하고 제 위치에서 벗어나 있지만, Acoustic focusing으로 촬영한 세포는 시야의 중앙에 선명하게 나타납니다.

Acoustic focusing은 최적의 이미징을 위해 세포를 배치합니다.

Acoustic focusing이 없으면(왼쪽), 비드가 중심을 벗어나 흐릿한 경우가 많습니다.  Acoustic focusing(오른쪽)은 선명한 이미지를 얻기 위해 측면 위치 변화, 시간 변동 및 심도 제한을 감소시킵니다. 

빠른 샘플 획득 속도

Acoustic focusing을 통해 실험실에서 고품질 데이터를 신속하게 획득할 수 있습니다.  기존의 hydrodynamic focusing 시스템에 비해 10배까지 더 빠른 12.5 µL/min 또는 1,000 µL/min의 시료 처리율과 초당 35,000개 이벤트 획득 속도를 달성할 수 있습니다. 따라서 저농도 샘플과 희소 샘플 등 모든 샘플을 품질 손실을 최소화하면서 보다 빠르고 정확하게 처리할 수 있습니다.

Time to acquire 1 million events

신속한 데이터 획득

 

최대 시료 속도로 실행되는 3개의 경쟁사 기기에서 1,000,000 이벤트를 획득하는 데 필요한 시간을 비교하였습니다.

Acoustic focusing은 시료 속도에 상관없이 변화를 최소화하므로 처리량과 감도 간에서 타협할 필요가 없습니다. 이것은 아래 세포 주기 분석 예에서 볼 수 있으며, 여러 세포 집단 간 형광 강도의 차이를 정확하게 검출하는 것이 매우 중요합니다.

Consistent data collection independent of sample flow rates between 12.5 and 1000 microliters per minute

최소한의 데이터 변동

 

Jurkat 세포를 고정, 프로피듐 요오드화물로 염색, RNase로 처리하고, 1 x 106 세포/mL의 농도에서 분석하였으며, 높은 시료 속도에서 일관된 결과를 얻을 수 있었습니다. G0/G1 및 G2/M 상에서 세포의 변동 계수(CV)는 1,000μL/분의 가장 높은 시료 속도에서도 일정하게 유지되었습니다.

“기존 항균성 민감도 검사는 박테리아의 성장, 분리, 민감도 검사가 얼마나 어려운지에 따라 1~3일이 걸릴 수 있습니다. Attune NxT를 사용하면 1시간 이내에 약물이 감염을 효과적으로 치료할 수 있을지 없을지를 알 수 있습니다. 그리고 3시간 이내에 박테리아 증식을 억제하는 데 필요한 최소 약물 농도를 정확하게 분석합니다.”

Kieran Mulroney,

생의학 과학 연구원

Harry Perkins Medical Research Institute

University of Western Australia

Clogging 방지 유체 공학

막힘을 방지하고 부피측정 분석이 가능하도록 하기 위해, Attune 유세포분석기는 양변위 시린지(syringe) 펌프를 사용하여 시료 부피를 제어합니다. 이 시스템은 알려진 부피(게이트 또는 총 이벤트)에서 부피측정 세포 계수를 수행할 수 있으며, 생존/사멸 분석 시에만 살아있는 세포의 수를 세기 위해 게이팅을 수행하여 죽은 세포를 쉽게 배제할 수 있습니다. 최대 15 PSI 압력에서 작동하는 기존 유세포 분석기와는 달리, Attune 유세포분석기는 75 PSI에서 압력을 제어하여 세포들간의 상호작용 가능성을 줄이고 막힘을 방지합니다.

 

“유세포 분석 작업에서 흔한 문제 중 하나가 clogging입니다. 이 장비를 사용하면 clogging이 과거의 일이 될 수 있습니다. 실행해야 할 시료가 너무 많아서 시료 사이에 모든 것을 제거할 시간이 없습니다.”

Bruno Sainz,

CLIP 연구원

Universidad Autónoma de Madrid

스페인 마드리드

부피측정 시료 입력

 

정변위 기능을 사용하여 시린지 펌프가 피펫처럼 작동합니다. 플런저를 아래로 누르면 장력이 생성됩니다(A). 플런저가 시료와 함께 상승하면 장력이 해제됩니다(B). 이러한 고압 제어 압력 환경에서는 clogging이 발생할 가능성이 낮습니다.

“우리는 다른 기계에서는 막힘 경향이 있는 종양에서 채취된 시료를 처리할 수 있는 유세포분석기가 필요했습니다. 그러므로 Attune NxT는 우리의 애플리케이션에 적합한 유세포분석기입니다. Attune NxT는 우리의 연구 프로그램을 위한 중요한 여러가지 특성을 갖추고 있습니다. acoustic focusing 기능이 있어 더 높은 시료 처리량을 지원할 뿐만 아니라, 더 큰 플로우 셀을 가지고 있습니다. 따라서 종양 세포를 살펴보고 종양으로부터 세포를 분리할 때 막힘을 걱정할 필요가 없으며, 장비를 다시 시작하고 가동해야 하는 많은 가동 중지시간에 대해 걱정할 필요가 없습니다.”

Charles Prussak,

PharmD, PhD

Cell Therapy Translational Laboratory (CTTL) 책임자

University of California San Diego

유연한 광학 설계

Attune 유세포분석기는 최대 4개의 공간적으로 분리된 레이저 및 16개의 파라미터를 사용하여 구성할 수 있습니다. 공간 분리는 multicolor 패널 설계를 위한 유연성을 제공하며 보정 효율을 높입니다.  이 시스템은 다양한 연구 요구 사항을 충족하기 위해 높은 감도를 갖추고 있으며 초당 최대 35,000 이벤트 수집 속도를 제공합니다.

 

감도가 높아 희미한 신호와 배경을 서로 구별하므로 변동성이 줄어들고 신호 분리가 향상됩니다. 형광 분해능 계수 변동은 단일 피크에 대해 3% 미만이며, 예상 MESF는 ≤80(FITC), ≤30(PE), ≤70(APC)입니다. 경쟁 관계에 있는 시스템과의 감도 비교는 다음과 같습니다.

유속 전체에서 감도 측정

561nm 레이저 및 610/20(A) 또는 610/15(B 및 C) 방출 필터를 사용하여 최첨단 기존 유세포 분석기(A)와 Attune NxT 유세포 분석기(B 및 C)에서 형광 마이크로 입자(Spherotech Rainbow 3.2 μm)를 실행했습니다. 기존 유세포 분석기는 가장 높은 감도 설정(~12.5μL/분)을 사용하여 실행되었습니다. Attune NxT 유세포 분석기는 기존 유세포 분석기와 동등한 12.5μL/분(B) 및 500μL/분(C, 40x 더 많은 시료)에서 실행되었습니다. Attune NxT 유세포분석기의 결과는 기존 유세포 분석기의 결과와 동일하거나 더 우수한 결과를 제공하였으며 최고 유속에서도 마찬가지였습니다.

소형 크기의 Attune 유세포분석기는 생물안전 후드 내에서 사용하기 위한 유연성도 제공합니다. 이로 인해, 위험하거나 알려지지 않은 시료를 다룰 때 오염 또는 감염을 피할 수 있습니다.

안정성을 위해 설계된 레이저

Attune 유세포분석기는 새로운 optical 설계를 통해 오랜 시간 동안 업계 최고의 신뢰성과 탁월한 성능을 제공하고 있습니다. 고체-상 레이저의 플랫-탑(flat-top) 빔 프로파일은 불안정성 또는 정렬 문제 및 기기 가동중단으로 이어질 수 있는 fluidics 또는 optics의 변경 영향을 최소화합니다.

 

레이저 정렬 불량은 기존 유세포분석기 사용자에게 있어 중요한 해결 과제입니다. Attune 유세포분석기에 사용되는 플랫-탑 레이저는 기존 시스템에 사용되는 가우시안 레이저(Gaussian laser)보다 더 넓은 정렬 범위를 제공하는 강도 프로파일을 가지고 있습니다.  또한 플랫-탑 레이저는 정렬 불량에 대한 내성이 높아 고감도 및 낮은 CV를 유지할 수 있습니다.

레이저의 방출 프로파일

 

정렬 불량이 있는 기존 유세포 분석기에 사용된 가우시안 레이저(왼쪽) 및 이동하면 적절한 정렬 상태를 보여주는 Attune 유세포분석기에 사용된 플랫 탑 레이저(오른쪽).

Rare 이벤트 검출

Rare 이벤트를 검출하려면 많은 수의 세포를 획득하여 신뢰할 수 있는 정확도로 측정해야 합니다. Attune 유세포분석기는 최대 1mL/min의 시료 입력 속도에서 희석 시료를 빠르게 처리할 수 있으며 60-100 µL/min의 최대 시료 입력 속도를 지원하는 기존 세포분석기보다 훨씬 빠릅니다. 이와 같이 acoustic focusing은 속도와 품질의 고유한 조합을 제공하여 긴 획득 시간에 걸쳐 rare 이벤트 수집에 소요되는 시간을 크게 단축시킬 수 있습니다.

 

 

1백만 개 이상의 살아있는 세포 수집 및 수지상 세포의 희귀 집단 검출

 

면역표현형 CD19 –/B220high/CD317+를 사용하여 Plasmacytoid dendritic cells (pDCs)가 식별되었습니다. 마우스 비장세포(splenocyte)를 CD19-Pacific Blue, CD317-Alexa Fluor 488, CD45R/B220-PE direct conjugates, 및 SYTOX AADvanced Dead Cell Stain이 포함된 4 개 색상으로 염색하였습니다. SYTOX AADvanced Dead Cell Stain을 사용하여 살아있는 세포에 게이트를 만든 다음 CD19 – 세포에 게이팅을 했습니다. CD45R/B220 대 CD317의 2개 매개변수 플롯을 사용하여 pDC를 식별했습니다. 500μL/분의 수집 속도를 사용하여 세포 농도 7.5 x 107 세포/mL로 총 세포 130만 개를 수집하였습니다. Plasmacytoid dendritic cell은 이중 B220+/CD317+(오른쪽 위 사분면)로 식별되었으며, 살아있는 CD19 세포의 0.851%를 구성하며, 이것은 총 비장세포의 0.194%입니다.

Attune 유세포분석기는 고속 획득과 고감도를 모두 지원하여  rare 세포의 간편한 검출과 표현형 분석, 기능적 특성 분석을 가능하게 합니다. 유세포분석 학습 센터에서 제공하는 rare 이벤트 검출을 위한 이 단계별 전략은 연구의 사전 분석, 분석 및 데이터 분석 단계를 위한 최상의 접근법을 통해 생각할 수 있도록 도움을 드립니다.

Attune CytPix 유세포분석기 특징

Attune CytPix 유세포분석기의 특징은 형태학적 데이터를 위한 고속 brightfield 카메라 및 자동 이미지 분석 기능입니다.

고속 카메라

이 카메라를 통해 초당 최대 6,000개 이미지를 캡처할 수 있으며, 사용자가 검출기에 의해 기록된 이벤트를 시각적으로 확인할 수 있습니다. 사용자는 실시간으로 이벤트 이미지를 확인하여 시료 품질을 확인하고, 프로토콜을 최적화하고, 분석을 위해 식별된 각 세포 집단의 형태를 기록할 수 있습니다. 이는 세포 치료제 애플리케이션에서 매우 중요하며, 모든 유세포분석 시료에 적용할 수 있습니다.

 

기존 유세포분석 프로토콜을 변경하거나 처리량을 감소시키지 않고 이미징을 추가할 수 있습니다. Attune CytPix 유세포분석기는 표준 유세포분석 획득 속도를 유지하면서 선명한 이미지를 캡처할 수 있습니다. 또한, 이미징에서 acoustic focusing의 장점을 얻을 수 있으며, 세포의 위치를 조정하여 정확하고 중심이 맞춰진 이미지를 얻을 수 있습니다.

높은 유속에서도 일관된 이미지 품질

 

Acoustic focusing 및 고속 카메라를 결합하여 유속(flow rates)이 느리거나 빨라도 CAR T 세포를 일관되게 이미징할 수 있습니다. 포커스(Foucs) 및 카메라 설정은 실험 요구 사항에 맞춰 조정하는 것이 용이합니다.

이미지 갤러리 보기를 사용하면  사용자는 세포 집단을 빠르게 스캔하여 이상값(outliers)을 바로 찾아낼 수 있습니다. 해당 보기에서 Doublet 및 기타 Aggregates가 어떻게 보이는지 확인하십시오. 사용자는 Attune CytPix 유세포분석기를 사용하여 기록 시간 내에 대규모 집단의 구조적 특징을 강조 표시할 수 있습니다. 이렇게 하여 세포군, 원치 않는 세포 및 Debris를 제외하고 관심 세포를 포함할 수 있도록 게이트를 조정할 수 있습니다.

높은 레벨 이미지 갤러리 보기.

초기 로그 단계(log phase)의 Jurkat 세포를 200 µL/min, >105 cells/mL로 Attune CytPix 유세포분석기에서 필터링하지 않고 획득하였습니다. 세포 이벤트를 빠르게 스캔하기 위해 이미지 갤러리 보기가 사용되었습니다.

이미지로부터 얻은 형태학적 정보는 멀티플렉스 염색만을 사용할 때보다 유세포분석 데이터를 더욱 풍부하게 합니다. 예를 들어, 아래 그림은 Annexin V와 propidium iodide(PI)을 사용한 기존의 Apoptosis 분석을 보여주는데, 각 집단에서 세포의 특징을 분석하기 위해 세포 이미징을 추가함으로써 형태학적으로 뚜렷한 특징을 나타내는 것을 볼 수 있습니다. 이러한 통찰은 유세포분석 데이터만으로는 얻을 수 없었을 것입니다.

Apoptotic cell의 형태학적 특성.

Apoptosis를 유도하기 위해 37ºC에서 4시간 동안 Jurkat 세포를 10 µM 캄토테신(camptothecin)으로 인큐베이션하였습니다. 시료는 Annexin V 및 PI로 염색되었고 100 µL/min로 Attune CytPix 유세포분석기에서 수집되었습니다. 단일 세포 집단에서 게이팅 전략은 3개의 세포 하위집단을 식별했습니다. 약 50%의 apoptotic live cells(Annexin V⁺PI-, 오른쪽 하단)는 소기포(bleb)와 같은 일부 형태의 apoptotic body를 나타냈습니다. 약 25%의 apoptotic dead cells(Annexin V⁺PI⁺, 오른쪽 위)는 Granularity가 증가했으며 더 많은 Partial cells가 관찰되었습니다. 약 10%의 건강한 세포(Annexin V-, 왼쪽 하단)는 apoptotic body를 나타내었습니다 (Annexin V⁺ 세포에서 관찰된 것처럼 심각하지는 않음). 이러한 건강한 세포도 형태학적으로 다양했으며 업스트림 단일 세포 게이팅에도 불구하고 몇몇 Doublet이 포함되었습니다. 이미지에서 형태학적 특징은 검은색 화살표로 표시하였습니다.

형태학을 위한 자동 이미지 분석

Attune CytPix 유세포분석기의 Attune 세포 분석 소프트웨어는 백혈구 및 비드에 대해 사전 학습된 모델을 사용하여 이미지의 세포 특징을 형태학적 파라미터로 분석하고 해석합니다.  캡처한 이미지와 플로우(flow) 데이터를 결합한 파라미터를 사용함으로써 연구원은 샘플에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다. 게이트(gate)는 Aggregates, Coincident Events, Debris 및 원치 않는 세포를 배제하도록 조정가능합니다.

 

이 소프트웨어는 초당 최대 1,000개의 이미지 처리 속도로 이미지 분석을 자동화하며, 소프트웨어 백그라운드에서 실행되는 처리 대기열에서 사용자가 관리할 수 있습니다. 확장된 이미지-파생 파라미터는 세포 수(입자 수) 및 원진도(원형도), 크기(제곱면적), 모양(편심률), 복잡도(엔트로피) 등의 형태학적 기능을 사용하여 Singlet을 확인하기 위한 데이터를 제공합니다.  이와 같은 확장 파라미터를 게이팅하면 수동 검토를 거의, 혹은 전혀 하지 않고도 대상 집단을 빠르고 정확하게 식별하여 게이팅 전략을 확인할 수 있습니다. 백게이팅을 사용하여 전체 해상도 이미지의 패널을 스캔하고 도트 플롯(dot plot) 상에서 산란, 형광 또는 이미지 기반 파라미터와 임의 집단의 상관 관계를 분석할 수 있습니다. 강력한 데이터 기반 세포 분석으로 게이팅 작업 시 데이터 품질과 신뢰성을 향상시킵니다.

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.