基于 LC-MS 的蛋白质治疗分析

Thermo Scientific 在 电荷变异体分析 HPLC 色谱柱上描述的 MAbPac 和 ProPac 色谱柱系列中提供阴离子和阳离子交换柱。其中，我们的 ProPac 3R SCX 和 ProPac 3R SAX 色 谱柱可为我们产品组合中的电荷变异体分析提供较先进的色谱柱技术。 ProPac 3R IEX 色谱柱采用新型单分散聚合树脂 ，可提供可靠的电荷变异体分析工作流程所需的分辨率，批间重现性和稳健性。

Thermo Scientific CX-1 pH 梯度缓冲液溶液 可通过阳离子交换色谱生成高重现性，线性 pH 梯度，如我们的 CX-1 梯度缓冲液产品规格表， 电荷变异体表征简单方法开发所述。

蛋白质治疗产品可在加工，递送和储存过程中进行各种生化修饰，已证明这些修饰会影响这些疗法的安全性和有效性。

氨基酸残基的氧化可通过提高氨基酸氧化形式的极性或导致治疗性蛋白质的构象变化来改变治疗性蛋白质的疏水性质。

虽然构象差异分析可以通过电荷差异分析完成，但基于疏水性的 HPLC 方法 (如反相液相色谱分析和疏水相互作用液相色谱 (HIC)) 已证明是最适合分离疏水性差异较小的蛋白变体的解决方案，如氧化变体。

导致构象差异的氧化可能来自生产过程中表面活性剂的相互作用或过程中的其他因素。因此，人们有兴趣监测整个生产过程中使用的表面活性剂，以发现与药物稳定性相关的任何不一致性的根本原因。高分辨率表面活性剂分析聚山梨醇 酯，这是生物制药生产中常用的表面活性剂，通过电雾式检测 (CAD) 可在应用指南中找到：通过 HPLC 分析质量和电雾式检测聚山梨醇酯 80。

Thermo Scientific MAbPac HIC-20 色谱柱 是具有独特专有固定相的高分离度，硅胶基质 HIC 色谱柱，具有独特的专有固定相，可提供高分离度和耐用的稳定性，特别适合抗体 (AB) 氧化和二硫化蛋白变体分析。在应用说明中进一步描述了使用 MAbPac HIC-20 色谱柱分离 mAb 氧化变异体 的应用说明在高分辨率 HIC 色谱柱上分离单克隆抗体 (mAb) 氧化变体。

抗体 - 药物偶联物 (ADC) 是一类生物制药药物，设计用于治疗癌症，通常由通过化学连接子共价连接到细胞毒性药物上的单克隆抗体组成。ADC 是抗癌药物研发的热门话题，因为它们将高特异性靶向能力的优势与高效杀伤效应相结合，以实现准确，高效的消除癌细胞。

药物偶联通常会导致 ADC 分子在单克隆抗体上分布和加载细胞毒性药物方面具有异构性。未结合单克隆抗体的效力显著降低，药物负荷高的 ADC 受到快速肾脏清除。

由于单克隆抗体所附着的药物数量已被证明可直接影响药物的安全性和有效性，因此在开发和生产过程中充分表征和监测 ADC 的异质性至关重要。

细胞毒素的附着改变了抗体的疏水性，从而在 HPLC 过程中，较弱疏水性的未结合抗体会首先洗脱，洗脱时间随着药物数量的增加而增加。因此， HIC 被认为是表征具有不同药物 - 抗体比 (DAR) 的 ADC 分子分布的首选方法–有关此主题的更多信息见应用说明 半胱氨酸连接的抗体 - 药物偶联物模拟物使用疏水相互作用色谱进行高分辨率分离。Thermo Scientific MAbPac HIC-Butyl 色谱柱 填充有 C4 键合聚合物颗粒以及聚合物颗粒的亲水性和丁基官能团的极佳密度，可实现出色的生物相容性，低残留和高分离度。

质谱分析 (MS) 也正成为一种常用的 ADC 表征方法，因为质谱能够更深入地了解 ADC 生物分子及其各种物种。对于 MS 应用，使用适合 MS 的溶剂很重要，因为其排除了 HIC 色谱柱的使用及其高盐含量。 Å 质谱兼容的另一种色谱柱是 Thermo Scientific MAbPac 反相 (MAbPac RP) 色谱柱，该色谱柱含有一种聚合物颗粒，孔径明显较大 (1500 μ m) ，可使蛋白质非常高效地扩散。聚合物吸附剂是一种针对疏水性的有效相互作用源，也使色谱柱非常稳健 ，可使用更强的有机溶剂，有效色谱柱清洁并减少残留。 NISTmAb 衍生的抗体 - 药物偶联物 (ADC) 标准品的论文开发 提供了基于 MS 的， NISTmAb 衍生的 ADC 标准应用方案的一个示例。

糖基化—糖部分与蛋白质的附着—是在翻译后修饰 (PTM) 过程中的一部分，以优化生物治疗药物的有效性。PTM 的特征为多种糖苷键，包括 N- ， O- 和 C 连接糖基化，腺苷酸化 (GPI 锚定附件) 和磷糖基化。

糖基化是单克隆抗体生物治疗药物的关键质量属性 (CQA) 之一，因为任何结构变化都会影响生物药物的安全性，有效性，清除率和免疫原性。

由于聚糖的极性，在亲水作用液相色谱分析 (HILIC) 色谱柱上最好对 mAb 释放的 N- 聚糖进行准确和精确定量。Thermo Scientific Accucore 150 酰胺 HILIC UHPLC色谱柱对实心核颗粒有独特的专有选择性，可以在不显著提高反压的情况下提高色谱柱的总体效率。有关实心核技术的更多深度说明，请访问我们的 Accucore HPLC 和 UHPLC 色谱柱 网页。Accucore 150 Amide HILIC 色谱柱具有 150 Å μ m 的孔径，更兼容多肽，可提供更高的峰形和更高的分离准确度。应用指南 使用 Accucore 150 酰胺 HILIC 色谱柱对 mAb 释放的 N - 聚糖进行准确和精确定量，描述了使用 Accucore 150 酰胺 HILIC 色谱柱时对人 IgG 释放的 N- 聚糖进行定量的有效性。

由于生物治疗药物的固有复杂性，监管机构需要对这些药物产品进行全面表征，以确保产品质量，安全性和有效性。蛋白翻译后修饰 (PTM) 的主要序列验证和相对定量是治疗性蛋白的重要表征步骤，通常使用肽图分析方法进行。

肽图分析用于测量任何生物治疗蛋白表征所需的多个关键质量属性 (CQA) ，并且涉及使用蛋白酶 (例如胰蛋白酶) 处理蛋白，以产生一系列通过液相色谱质谱 (LC-MS) 分离，检测和分析的肽。液相色谱 - 质谱分析和相关的多属性方法 (MAM) 分析可以按照文章中所述，同时对广泛的 CQA 进行表征和监测 优化的多属性方法工作流程解决缺失的切割和疏水性肽的色谱加尾 / 残留。

宿主细胞蛋白 (HCP) 是生物治疗生产过程中来自中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞宿主生物的工艺相关杂质，也可以通过使用 UHPLC-MS 应用设置通过对常见 CHO 肽的 NISTmAb 验证进行肽图分析。

各种 Thermo Scientific 色谱柱可用于肽图分析。Thermo Scientific Acclaim VANQUISH C18 UHPLC 色谱柱 µm 保留性能高，包含 2.2 μ Å m 硅胶颗粒，孔径为 120 μ m。这些色谱柱的表面积 m² 为 300 μ g/g 和 18% 的碳含量，可确保极大程度地保留复杂样品，如用于肽图分析。

Thermo Scientific Hypersil GOLD C18 色谱柱 也填充有与短丁基链键合的超纯硅胶颗粒，用于弱疏水保留，因此特别适用于肽图分析。硅胶质量极大限度地减少了可能导致峰拖尾等意外保留的次级相互作用。Hypersil GOLD C18 的孔径为 175 μ m ， Å 扩散，对质量转移的抗性更低，并对肽的峰形高度有利。

无论您选择哪种色谱柱， Thermo Scientific SMART Digest 胰蛋白酶试剂盒都 能为生物制药蛋白研究的样品制备提供重大进步。该试剂盒提供了一种快速简单的蛋白质消化方法，可按照兼容自动化操作的形式提供高重现性，高灵敏度和高数据质量，将消化所花费的时间缩短至 45 分钟。请访问我们的 HPLC 和 MS 肽图分析蛋白酶切 网页，了解更多信息。