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SARS-CoV-2 血清学检测
血清学检测有利于研究人员通过测量血液（血清或血浆）中 SARS-CoV-2 抗体的存在来确定受试者是否已感染严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2)，也就是导致 COVID-19 的病毒。抗 SARS-CoV-2 抗体检测依赖于免疫反应，并可能受多种因素影响，包括病毒暴露量、症状发作后评估阶段、年龄、性别和健康状况。因此，血清学检测的灵敏度和特异性对于准确可靠检测抗 SARS-CoV-2 抗体来说非常重要。
Invitrogen 公司可提供多种 SARS-CoV-2 的 ELISA 试剂盒来测量 Ig 抗体、中和抗体和病毒相关蛋白。
这款 ProcartaPlex Human Coronavirus Ig Total 11-plex panel 适用于检测人血清中的多种抗 SARS-CoV-2（三聚体刺突、S1、RBD、N）Ig 抗体和其他 6 种冠状病毒毒株，有助于提供更完整的抗体分析。
SARS-CoV-2 多重血清学检测
ProcartaPlex Ig Total （最多 14-plex，包括变体）
在 SARS-CoV-2 感染期间，蛋白作为主要抗原刺激产生 IgA、IgM 和 IgG 抗体的免疫应答，这些蛋白包括核衣壳 (N)、刺突 (S) 蛋白和刺突蛋白质亚区域，例如受体结合结构域 (RBD) 和 S1 亚基。核衣壳 (N) 蛋白在 SARS-CoV-1 和 SARS-CoV-2 (1) 之间具有极高同源性 (90％)。在 SARS-CoV-2 大流行早期，已针对核衣壳蛋白开发出检测其抗体的血清学检测试剂盒，该抗体具有更明显的交叉反应性，因此接触 SARS-CoV-1 (1) 的受试者的假阳性读数更高。SARS-CoV 刺突 (S) 蛋白组成三聚体结构，形成冠状（日冕）外观，并由 S1 和 S2 亚基组成。在 S1 中，位于 C 端亚结构域的受体结合结构域 (RBD) 与 N 端结构域相比，SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 之间具有更高的同一性 (74％)，这与 SARS-CoV-2 使用 ACE2 作为受体进入 SARS-CoV (2) 等宿主细胞结果一致。RBD 已被确定为 SARS-CoV-2 刺突蛋白的免疫显性位点之一，含刺突蛋白抗体，与中和作用密切相关。此外，地方性和季节性冠状病毒的血清学交叉反应检测也非常重要，用于排除假阳性结果。使用 Luminex xMAP 技术，Human Coronavirus Ig Total 11-Plex ProcartaPlex Panel 可以在一个检测孔中筛查四种 SARS-CoV-2 抗体（三聚体刺突、S1 亚基、RBD 和 核衣壳蛋白）、六种冠状病毒毒株 （SARS-CoV-1、MERS、CoV-NL63、CoV-KHU1、CoV-229E、CoV-OC43）和一种阴性对照物。
此外，3 种变体可以与此 11-plex panel 进行组合，以形成一次 14-plex 检测。这 3 种变异蛋白包括源自英国 (B.1.1.7) α、南非 (B.1.351) β 和巴西 (P.1) γ的变体。通过一次检测同时检测血浆或血清样品中的抗 SARS-CoV-2 抗体及相关冠状病毒抗体，不仅获得了全面完整的数据集，还节省了检测时间。
Neutralizing Antibody 4-plex Panel
Human SARS-CoV-2 Variants Neutralizing Antibody 4-Plex ProcartaPlex Panel 可以在一个检测孔中筛查出四种中和抗 SARS-CoV-2 抗体-- 原始野生型和 3 种变体（B.1.1.7 (α)、B.1.351 (β) 和 P.1 (γ)）。这种血清学检测是以 SARS-CoV-2 野生型或变异型蛋白与磁珠结合而设计的。在中和抗体会与蛋白质结合的地方添加了样品或对照组。这是一场竞争性检测，其中的检测抗体是一种生物素化的 ACE-2，会与任何未结合的蛋白质结合。加入了链霉亲和素 (PE)，信号与存在的特异性中和抗体的数量成间接比例。阴性对照组会给出最高的 MFI 值。
图 1.展示了用于 SARS-CoV-2 变体的 Invitrogen ProcartaPlex 4-plex Neutralizing Antibody panel 的原理的示意图
图 2.62 个 PCR (+) 样本对野生型 (WT) 和 3 个变体的中和抗体的筛选结果。 WT 和 B.1.1.7 之间没有显著差异。然而，可观察到与 WT 相比，B.1.351 和 P.1 变体在中和率上有显著差异。
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图 3.SARS-CoV-2 抗原 39 个 Covid PCR (+) 和 168 个健康 PCR (-) 对照的筛查结果。结果显示了三聚体刺突蛋白、S1、RBD 和核衣壳抗原的抗体水平，与 PCR (+) 高抗体水平和 PCR (-) 样品低抗体水平的预期结果相对应。
图 4.4 种普通感冒冠状病毒 39 个 Covid PCR (+) 和 168 个健康 PCR (-) 对照的筛查结果。结果显示，PCR (+) 和 PCR (-) 组之间无差异，该数据反映了一般人群先前暴露于普通感冒冠状病毒的情况。此外，该结果重点突出了 11-plex ProcartaPlex panel 通过一次检测评估普通感冒冠状病毒相关性的能力。
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图 5.无假阳性结果。在 COVID-19 大流行之前，2016 年和 2017 年采集的 110 个健康样品均低于 4 种 SARS-CoV-2 抗原的临界值（数据见图示），而其他 2 个供应商试剂盒给出了约 10％ 的假阳性数据，共有 12 个样品高于临界值（数据未显示）。
针对重症 SARS-CoV-2 受试者的靶向分析：从转录组到蛋白质组
来自 Western University 的 Douglas Fraser 博士介绍了 ProcartaPlex Coronavirus Ig Total 11-plex Panel 的使用，其可用于更好地了解 SARS-CoV-2 免疫反应，并最终为进入重症监护室 (ICU) 的 Covid-19 患者制定战略性治疗计划。在进入 ICU 的第 1、3、7 和 10 天采集受试者的血浆样品，并使用 11-plex panel 筛查抗体水平。
SARS-CoV-2 ELISA 血清学检测
用于血清和血浆的 Ig ELISA
Human SARS-CoV-2 刺突（三聚体）Ig ELISA（酶联免疫吸附测定）试剂盒设计用于测量与 SARS-CoV-2 刺突（三聚体）结合的 Ig 抗体量。在所提供微孔板孔中预包三聚体刺突蛋白。然后，将样品和对照品（包括可用作标准品的高对照品）添加到这些孔中并与固定化的（捕获）刺突蛋白发生结合。洗涤微孔，加入 HRP 偶联的抗 Ig 并与捕获抗体发生结合。洗涤微孔，加入底物溶液并与酶复合物发生反应，产生测量信号。该信号强度与原始样品中的抗体浓度直接成正比。
图 6.展示了用于 SARS-CoV-2 的 Invitrogen Ig Antibody ELISA 的原理的示意图
用于血清和血浆的中和抗体 ELISA
SARS-CoV-2 Neutralizing Ab ELISA 试剂盒设计用于测量抗 SARS-CoV-2 抗体的中和部分。在所提供微孔板孔中预包受体结合结构域 (RBD) 蛋白。将样本或阳性对照物添加到孔中。样本中存在的会与 RBD 特异性结合的中和抗体将阻断与随后加入的生物素化 ACE2 的任何互动。来自 SA-HRP 的信号与存在的特异性中和抗体的数量成间接比例。
图 7.展示了用于 SARS-CoV-2 的 Invitrogen Neutralizing Antibody ELISA 的原理的示意图
图 8.Ig 检测的特异性和敏感性为了确立用于临界值的校准物，运行了 39 个 PCR (+) 和 160 个 PCR (-) 样品，以确定所有 PCR (-) 样品位于下方，所有 PCR (+) 位于上方。请注意，其中 2 个 PCR (+) 样品显示出低抗体水平。经其他血清学检测确认，这两个样品为阴性。
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图 9.中和抗体检测的特异性和敏感性为了确立一个 20% 中和临界值的校准物，运行了 114 个 PCR (+) 和 12 个 （对照物）样本，以确定所有 PCR (-) 样品是否低于这个水平。
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图 10.使用刺突 S1 亚基抗原和 IgG，进行我们的 ELISA 试剂盒对竞争对手的 ELISA 试剂盒的基准测试。包括临界健康对照样品。红色箭头指示了 4 个差异示例，其中在竞争试剂盒中，健康样品显示假阳性结果，而 3 个阳性样品显示阴性结果或临界值。我们的 Invitrogen 试剂盒与预期 PCR 结果具有更好的相关性。
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图 11.与其他供应商的 SARS-CoV-2 代用病毒中和试验 (sVNT) 和传统 VNT 进行对标。 Invitrogen ELISA 显示出与其他供应商的 ELISA 蚀斑减少中和试验 (PRNT) 有极强的相关性。
用于 SARS-CoV-2 研究的细胞因子风暴检测
严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 感染可导致细胞因子水平升高，也称细胞因子风暴，其为急性呼吸窘迫综合征 (ARDS) 和多发性器官衰竭的主要原因之一。这种细胞因子风暴或细胞因子释放综合征 (CRS) 的特征是，细胞因子网络平衡失调，促炎反应升高，抗炎反应不足，导致免疫系统稳态失衡。测量与 SARS-CoV-2 感染所致细胞因子风暴综合征 (CSS) 或细胞因子释放综合征 (CRS) 相关的细胞因子。
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参考文献
- Okba N, Müller MA, Li W, Wang C, GeurtsvanKessel CH, Corman VM, et al.Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2−Specific Antibody Responses in Coronavirus Disease Patients. Emerg Infect Dis.2020;26(7):1478-1488.
- Jaimes JA, André NM, Chappie JS, Millet JK, Whittaker GR.Phylogenetic Analysis and Structural Modeling of SARS-CoV-2 Spike Protein Reveals an Evolutionary Distinct and Proteolytically Sensitive Activation Loop.
J Mol Biol.2020;432(10):3309-3325.
Publications using the Human Coronavirus Ig Total 11-plex Panel
- Borena, W.; Kimpel, J.; Gierer, M.; Rössler, A.; Riepler, L.; Oehler, S.; von Laer, D.; Miholits, M. Characterization of Immune Responses to SARS-CoV-2 and Other Human Pathogenic Coronaviruses Using a Multiplex Bead-Based Immunoassay. Vaccines 2021, 9, 611.
- Fraser DD, Cepinskas G, Slessarev M, Martin CM, Daley M, Patel MA, Miller MR, Patterson EK, O'Gorman DB, Gill SE, Oehler S, Miholits M, Webb B. Detection and Profiling of Human Coronavirus Immunoglobulins in Critically Ill Coronavirus Disease 2019 Patients.Crit Care Explor. 2021 Mar 12;3(3):e0369.
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