Thermo Fisher Scientific 为细胞信号研究提供了各种高质量免疫检测解决方案。该产品涵盖了方便的 ELISA 试剂盒,并涵盖了多通路解决方案,包括新型 ProcartaPlex Dual Reporter 检测组合。这些 ProcartaPlex Dual Reporter 测定可在单个孔中同时检测和定量多种蛋白质的磷酸化和总形式。 不同的检测形式提供了研究细胞信号通路各个方面的灵活性,包括蛋白表达,磷酸化和活化。

细胞信号概述

细胞信号传导是一个复杂的过程,细胞通过它相互进行通讯来协调其活动并对环境的变化作出响应。这个过程涉及通过各种信号通路在细胞之间传递信号,通常是由配体与细胞表面的受体结合启动的。有几种不同类型的信号通路,包括细胞之间传输信号的不同机制。

信号传导的类型:

  • 细胞内信号通路 涉及在单个细胞内传递信号,通常通过活化各种蛋白激酶和其他信号转导分子来传递信号。
  • 分泌信号通路涉及相邻细胞之间的信号传导,而自分泌信号通路涉及从细胞到自身的信号转导。
  • 内分泌信号 通路涉及通过血流将信号传输到全身。

无论涉及的信号通路类型如何,细胞信号转导都使细胞能够协调其活动并对环境变化做出适当响应。这一过程对于维持体内稳态至关重要,可确保细胞以协调和高效的方式发挥其各种功能。

AKT 通路是最广泛研究的,具有显著相关性 的信号通路之一,因为它在调节细胞生长,存活和代谢方面发挥着关键作用。AKT 通路由各种细胞外信号激活,包括生长因子,激素和细胞因子。一旦激活, AKT 通路可调节多种细胞过程,包括葡萄糖代谢,蛋白质合成和细胞增殖的调节。该方法通过磷酸化各种下游靶标 (包括 mTOR 复合物和糖原合酶激酶 3 (GSK3) (图 1) 来实现这一点。

Graphic of the Akt signaling cascade with the involved proteins

图1.AKT 信号通路。AKT 信号转导通路通过胰岛素或胰岛素生长因子 (IGF) 等生长因子活化,促进类似 IGF-1R 的相应受体酪氨酸激酶 (RTKs) 磷酸化,通过 IRS-1 , AKT , GSK-3 β , mTOR 或 CREB 等下游靶标磷酸化增殖进一步信号转导,以调节与肿瘤发育相关的细胞过程,包括细胞凋亡,基因转录,细胞周期进展和细胞代谢调节子。

通用的检测方法

研究细胞信号通路的最常用技术之一是使用生化和蛋白检测。这些检测涉及细胞组分的分离和操作,以研究通路内特定信号分子的活化和调节。

检测的示例包括:

  • 免疫印迹和 Western 印迹 (或 Western 印迹) ,可用于检测和定量特异性蛋白
  • 可用于研究蛋白 - 蛋白相互作用的免疫沉淀
  • 酶活性检测,用于测量信号转导通路中涉及的酶的活性
  • ELISA (酶联免疫吸附测定) ,用于测量特定蛋白浓度
  • 多重检测,如 ProcartaPlex ,后者使用基于微球的技术同时定量多个蛋白质
     

表 1. 某些选定检测的比较表。

 

免疫印迹ELISAProcartaPlexProcartaPlex
双报告
适用于蛋白验证,确认和目视鉴定具有特异性和灵敏度的单靶点分析高通量,用更少的样品分析更多的生物标志物多通路检测并测量同一蛋白的两个参数
样本类型多种 (例如裂解物和纯化蛋白)多种 (细胞和组织裂解物,血浆,血清,其他体液,细胞培养物上清液, 等)
蛋白质形式变性天然分子
需要提取蛋白
定量半 / 相对 定量定量;通过校准曲线 

检测范围

低至中等浓度低至高浓度
蛋白质大小分子量蛋白的大小分离和测定没有有关蛋白大小的信息

多重标记

多达 4-Plex 荧光多重检测或联排分析和重新检测化学发光检测多达80个反应8 种分析物的多达 2 个参数

ELISA 和微球检测

ELISA 和基于微球的多通路检测是研究细胞信号通路的广泛使用的工具。使用免疫检测的主要原因是其灵敏度,特异性,简单的实验方案和高通量能力。此外, ELISA 和 ProcartaPlex 测定均与其他传统实验室方法 (如 Western 印迹) 高度相关。通过利用 ELISA 和 ProcartaPlex 检测,研究人员可以阐明细胞信号通路的复杂机制,从而促进旨在解决多种疾病的创新治疗干预方法的发展。

表 2. 重点介绍用于研究细胞信号的免疫学测定的出版物列表。

磷酸化特异性 ELISA 试剂盒

磷酸化状态异常与癌症等许多人类疾病有关。研究关键蛋白质靶标的磷酸化和翻译后修饰对于更好地理解疾病背后的机制至关重要。我们提供磷酸化特异性 ELISA 试剂盒,用于检测许多与多种疾病相关的关键靶标和信号通路(包括 STAT3、CREB、PRAS40、p38、AMPKα、PTK2 和胱天蛋白酶 3 信号传送)的磷酸化状态。这些试剂盒有两种不同的形式——标准 ELISA 和 InstantOne ELISA 试剂盒。这两种试剂盒都有助于确保出色的检测结果和重现性。试剂盒必须满足灵敏度、动态范围、精度、特异性、回收率和批间一致性的质量控制规范。

检索 ELISA 试剂盒

常见研究蛋白靶标和 ELISA 试剂盒性能数据

表3.查看用于检测以下常见磷酸化靶标的赛默飞 ELISA 试剂盒:

预包被磷酸化 ELISA 试剂盒

Invitrogen 预包被磷酸化 ELISA 试剂盒使用标准 ELISA 形式,包括预包被捕获抗体 (靶标特异性) ,其中依次加入样品或标准品和检测试剂。这些试剂盒配有蛋白标准品,可生成定量结果的标准曲线,设计用于检测和定量细胞裂解物中的磷酸化蛋白。图 2 显示了 Jurkat 细胞中的总 AKT 和 AKT [pS473] 的水平,并证明了 AKT 磷酸化和 PI-3 激酶活之间的关系。预包被磷酸化 ELISA 试剂盒的特异性已通过肽竞争试剂盒检测得到证实 (图 3) ,而分析灵敏度是通过比较蛋白质印迹和 ELISA 与已知数量的磷酸化蛋白 (如 AKT [pS473]) 来测定。

预包被磷酸化 ELISA 试剂盒的优势

  • 定量——获取定量数据以补充蛋白质印迹图像
  • 特异性——两种针对分析物的抗体具有比蛋白质免疫印迹法更好的特异性
  • 灵敏度——比蛋白质免疫印迹法更灵敏,通常只需要 2,000-3,000 个细胞
  • 中等处理量——96 孔形式,4 小时得出结果,不需要密度测定分析
AKT-in-jurkat-cells-1200x638

图2:使用 AKT ELISA 测量 Jurkat 细胞中总 AKT 与磷酸化 AKT 的测量。 将 Jurkat 细胞的渥曼青霉素 (一种 PI-3 激酶抑制剂) 浓度增加 (0~500 nm) ,用于 Jurkat 细胞的处理。用 AKT (Total) Human ELISA 试剂盒 (货号 2373) 裂解细胞,并同时检测 AKT [Total ] 和磷酸化 AKT [pS473] 的情况号  人源 KHO0101) 和 AKT (磷酸化) [pS473] ELISA 试剂盒 (货号. KHO0111) .图表显示,总 AKT 数量保持相当,然而,丝氨酸 473 的磷酸化水平以剂量依赖性方式降低,渥曼青霉素增加。

specificity-of-AKT-ELISA-1200x825

图3.AKT [pS473] ELISA 的特异性。 进行肽竞争检测,以确认 AKT [pS473] 的特异性。用 AKT (Phospho) [pS473] Human ELISA 试剂盒 (货号 KHO0111)。该图显示,只有对应于丝氨酸 473 周围区域的肽才会阻断 ELISA 信号。

sensitivity-of-AKT-ELISA-1200x243

图4.AKT [pS473] ELISA 的分析灵敏度。 Jurkat 细胞在最佳条件下培养,并获得磷酸化 AKT 细胞提取物。在细胞裂解物中使用 AKT (磷酸化) [pS473] Human ELISA 试剂盒 (货号 KHO0111) 和 Western Blot。AKT [pS473] ELISA 的分析灵敏度通过在 30 次检测内获得的平均外径上增加两个标准差来确定。数值 <0.8 单位 /mL 对应于从 4000 个 Jurkat 细胞中提取的 AKT [pS473] 的量。结果显示,根据已知量的 AKT [pS473] 进行检测时, ELISA 的灵敏度是 Western 印迹的 ~2 倍。

Invitrogen InstantOne 磷酸化 ELISA 试剂盒

Invitrogen InstantOne 磷酸化 ELISA 试剂盒包含传统 ELISA 中使用的所有试剂,加入 InstantOne 检测板的溶液中。这些试剂盒具有精简的工作流程,其中靶标分析物可结合两种溶液中的夹心 ELISA 抗体,而捕获抗体通过专有机制与板结合。这些检测板可快速分析样品,实现简单的一次清洗方案。使用 3 , 3' , 5 , 5'- 四甲基联苯胺 (TMB) 比色底物进行特定分析物的检测。

这些试剂盒设计用于准确测量细胞裂解物中的总蛋白和 / 或磷酸化蛋白。InstantOne 检测已通过 ELISA 验证,可检测多种关键靶标,包括 NF- kb , p38 MAPK(图 5) , SMAD1 (图 6) ,并且通过免疫印迹分析评估特异性。

包被 InstantOne 磷酸化 ELISA 试剂盒的优势:

  • 灵活性—能够在单个板上检测单个蛋白的总水平和/或磷酸化蛋白水平
  • 特异性—两种针对分析物的抗体提供比 western 印迹更好的特异性
  • 灵敏度—比 western 印迹更灵敏,通常只需要 2,000-3,000 个细胞
  • 高通量—1 小时和 1 次洗涤方案
p38-MAPK-pT180-pY182-in HEK293-cells-1200x488

图 5.使用 InstantOne ELISA 检测 HEK293 细胞中的人 p38 MAPK [pT180/pY182]。 HEK293 µg 用 2 μ g/mL 茴香霉素 (p38 /JNK MAPK 通路的有效激活剂) 处理 30 分钟 未处理的 HEK293 细胞 (-) 用作阴性对照。通过 Western 印迹 (右) 和 ELISA (左) 用 gp38 MAPK (磷酸化) [pT180/pY182] 多物种 InstantOne ELISA 试剂盒 (货号No. 85-86022-11).通过免疫印迹检测到 38 kDa 条带的强度与 InstantOne ELISA 吸收值有关。

total-and-phosphorylated-SMAD1-i- C2C12-cells-1200x573

图 6.使用 InstantOne ELISA 检测 C2C12 细胞中的 SMAD1 (总 / 磷酸化)。 C2C12 细胞要么被染色体丙型 (50 mM) 抑制 60 分钟) (-) ,要么被 BMP4 (10 ng/mL) 刺激 30 分钟 (+)。裂解物按照 InstantOne ELISA 用户手册中的说明制备。µg  SMAD1 (10 μ L/ 检测) 或磷酸化 SMAD1 [S463/S465] (右) 检测总 SMAD1 (总 / 磷酸化) InstantOne ELISA 试剂盒 (货号No. 85-86183-11).

细胞信号 ProcartaPlex 多重免疫测定

ProcartaPlex 是一种基于 Luminex 微球的多重免疫检测,可在单个孔中同时定量多个分析物。可同时定量测定总蛋白和 / 或磷酸化蛋白形式。这有助于揭示研究细胞信号通路中复杂的相互作用。

从我们专为测量总蛋白或磷酸化蛋白而设计的经典 ProcartaPlex 形式中选择,或发现用于 Luminex xMAP INTELLIFLEX DR-SE 仪器的新型 ProcartaPlex 双报告分子检测,其具有独特的功能,可以在同一个微球上同时定量多达 8 种蛋白的磷酸化和总形式 (表 4)。

ProcartaPlex 细胞信号测定的优势:

  • 可比性—可获得与 ELISA (图 7) 和 Western 印迹分析 (图 8) 相当的结果,并且多通路技术具有额外好处
  • 动态范围宽且灵敏度增强—即使是低丰度蛋白质和信号分子也可以进行检测 (图 9)
  • 双报告基因多重—可在单个孔中同时检测同一微球上的多种磷酸化蛋白和总蛋白 (图 10)

这种多重检测功能可节省时间和宝贵的样品材料,有助于更有效地获得全面的数据。与 ELISA 和 Western 印迹相比,多重检测手动操作时间更短,通量更高,可显著提高信号研究的效率。

表 4. ProcartaPlex 细胞信号检测有多种规格。

 

ProcartaPlexProcartaPlex Dual Reporter
总蛋白(仅限)x
磷酸化蛋白 (仅限)x

总蛋白和磷酸化蛋白 *

x
多重,适用于细胞信号最多8个最多16个
(8 种分析物的 2 个参数)
板规格96孔96孔
Luminex 仪器xMAP INTELLIFLEX 和 xMAP INTELLIFLEX DR-SE 系统
FLEXMAP 3D 系统
Luminex 200 系统
MAGPIX 系统
xMAP INTELLIFLEX DR-SE系统
上样量25 μL 预稀释的裂解物25 μL 预稀释的裂解物
读取时间4 小时4 小时
检测规格
预混 Panel
混合与匹配
单因子试剂盒x

工作原理:

Schematic images of the ProcartaPlex and ProcartaPlex Dual Reporter assay designs

A) 对于 ProcartaPlex 测定, Luminex 微球与特异性结合信号转导蛋白的捕获抗体偶联,无论其磷酸化状态如何。特异性抗体与不同微球编码的偶联能够在单个孔中分析多种分析物。创建单独的检测组合,用于使用不磷酸化特异性或磷酸化特异性检测抗体和 PE 染料针对报告通道 1 (532nm) 对总信号蛋白或磷酸化信号蛋白进行多通路分析,使其与所有 Luminex 仪器兼容。

(B) 对于 ProcartaPlex 双报告基因测定,应用相同的捕获抗体,但用于定量磷酸化信号转导蛋白使用磷酸化特异性检测抗体 (带有 BV421 偶联) ,它利用 Luminex xMAP INTELLIFLEX DR-SE 仪器的额外报告通道 2 (405 nm)。使用 PE 染料通过报告通道 1 (532 nm) 检测总蛋白。该方法可同时定量在同一微球上单个孔中的总蛋白和磷酸化蛋白。

多重细胞信号通路的优势

蛋白免疫印迹是一种用于鉴别和检测蛋白质靶标及其翻译后修饰状态的常用技术。蛋白免疫印迹技术的简单性和灵活性特别适用于基础工作和验证。然而,在细胞信号研究中,对多种蛋白进行分析的需求及其磷酸化状态通常与大量样品结合在一起。这一事实使多重分析成为该研究领域的一个有价值工具,它允许在单个样品中同时定量多种分析物,同时节省时间,样品体积和实现高通量。多重检测方案类似于 ELISA 检测。ProcartaPlex 检测显示与 ELISA (图 7) 和蛋白质免疫印迹 (图 8) 有较高的相关性,且显示出出色的灵敏度 (图 9)。此外,创新的 ProcartaPlex Dual Reporter 检测试剂盒可在单个孔中同时定量分析同一个磁珠上的总蛋白和磷酸化蛋白 (图 10)。

ProcartaPlex 信号检测组合和性能数据

图7.比较数据显示了 ProcartaPlex 信号测定与传统 ELISA 的相关性。各种细胞系裂解物重复使用,并在 ProcartaPlex 信号转导 Simplex 试剂盒 (货号EPX010-97101-Pho,货号EPX010-97106-Pho,  货号EPX010-97102-Pho) 和 ELISA 试剂盒 (货号KHO0111,货号KHO0421,货号KHO0241)。  Akt [pS473] 、 PRAS40 [pT246] 和 CREB [pS133]  的测量浓度 数据显示高度相关性 (R2 > 0.8)。这表明, ProcartaPlex 信号单因子检测试剂盒可获得与传统 ELISA 试剂盒相当  的定量结果,并且该试剂盒具有多重技术的额外优势,包括减少样品量,缩短测定 / 手动操作时间以及降低每个数据点的成本。 

图8.ProcartaPlex 和蛋白质免疫印迹的比较数据。使用 Western 印迹和 ProcartaPlex 人 AKT 通路双报告基因检测组合 2x8plex (货号EPX080-97200-DR) 显示了两个检测系统之间的高相关性。Western 印迹数据显示,裂解 NIH-3T3 细胞中的 PRAS40 [pT246] 水平 (40 kDa)。10µg 定量的蛋白 (μ g) 用于蛋白免疫印迹和 ProcartaPlex 检测。ProcartaPlex 人 AKT 通路双报告基因检测组合, 2x8plex (货号按用户指南执行了 EPX080-97200-DR)。在蛋白质印迹分析中,使用 Bolt 4 至 12% , Bis-Tris , 1.0 mm ,小型蛋白凝胶 17 个槽 (货号. NW04127BOX)、XCell SureLock 电泳系统(货号 No. EI0002) and PageRulerPlus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa (Cat.号. 26619).然后将分离蛋白 转印到硝酸纤维素膜上 iBlot 2 转印膜组,硝酸纤维素膜 (货号 IB23002) 带 iBlot 2 干式印迹系统。使用 iBind Solution Kit(货 号 SLF1020)。使用 SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物(货 号. 34577)

图9.ProcartaPlex 信号检测和蛋白质免疫印迹的分析灵敏度比较。Jurkat 细胞在最佳生长条件下培养,并使用细胞裂解物测量磷酸化 CREB。µg 1 : 2 连续稀释用相同量 (10 μ g) 的蛋白,并使用 ProcartaPlex CREB [pS133] Simplex 试剂盒 (货号. EPX010-97102-Pho) 和 Western 印迹检测。对于 Western 印迹,使用相同的针对 PRAS40 [pT246] 的磷酸化特异性检测抗体,如 Simplex 试剂盒所含。µg 免疫印迹测定的最低浓度为 5 μ L/ 孔 µg ,使用 ProcartaPlex 单因子检测试剂盒测定的最低浓度为 0.6 μ L/ 孔。

图10.常规 ProcartaPlex 和 ProcartaPlex Dual Reporter 规格之间的相关性。ProcartaPlex Human Akt Pathway Dual Reporter Panel, 2x8plex (货号EPX080-97200-DR) 与 ProcartaPlex Human Akt Pathway Panel (total) , 8plex (货号EPX080-97000-901) 和 Akt Pathway Panel (phospho), 8plex (货号EPX080-97100-Pho) ,用于评估 AKT 信号转导通路中涉及的总蛋白或磷酸化蛋白。获得的数据表明,双报告基因 Panel 与总蛋白或磷酸化蛋白 (R2 > 0.9) 的常规检测组合之间存在强烈的相关性。

表 5.用于研究细胞信号转导的预混 ProcartaPlex 多重免疫检测组合。

用于定量总蛋白和磷酸化蛋白的双报告基因检测 panels
产品名称规格货号

靶标列表 [微球编码]:

AKT + Akt [pS473] [47] , CREB + CREB [pS133] [43] , GSK-3 β + GSK-3 β [pS9] [56] , IGF-1R + IGF-1R [pYpYpYpY1135/1136] [34] , IRS-1[ps312] [37] , PRAS40 + [pT2441] [pT2441]

96孔EPX080-97200-DR

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用于定量总蛋白的检测组合
产品名称规格货号

ProcartaPlex Human Akt Pathway Panel (total), 8plex

靶标列表 [微球编码]:

AKT [47] , CREB [43] , GSK-3 β [56] , IGF-1R [34] , IRS-1 [37] , mTOR [26] , PRAS40 [42] , p70S6K [27]

96孔EPX080-97000-901
检测组合用于磷酸化蛋白定量
产品名称规格货号

ProcartaPlex Human Akt Pathway Panel (phospho), 8plex

靶标列表 [微球编码]:

Akt [pS473] [47] , CREB [PS133] [43] , GSK-3 β [pS9] [56] , IGF-1R [pYpY1135/1136] [34] , IRS-1[pS312] [37] , mTOR [Ser2448] [26] , PRAS40 [pT246] , [pT246] , [pTpS421/424] [27]

96孔EPX080-97100-PHO

请注意:用于总蛋白的 ProcartaPlex Simplex 试剂盒可以彼此结合。用于磷酸化蛋白的单因子试剂盒也是如此。无法组合用于总蛋白和磷酸化蛋白的单因子试剂盒。如果您想要定量单个 panel 中的总蛋白和磷酸化蛋白,可以使用 ProcartaPlex Panel 选择工具来设计您的 Panel。然而,请务必注意,这些检测组合只能在 Luminex xMAP INTELLIFLEX DR-SE 仪器上运行。

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细胞信号概述

细胞信号传导是一个复杂的过程,细胞通过它相互进行通讯来协调其活动并对环境的变化作出响应。这个过程涉及通过各种信号通路在细胞之间传递信号,通常是由配体与细胞表面的受体结合启动的。有几种不同类型的信号通路,包括细胞之间传输信号的不同机制。

信号传导的类型:

  • 细胞内信号通路 涉及在单个细胞内传递信号,通常通过活化各种蛋白激酶和其他信号转导分子来传递信号。
  • 分泌信号通路涉及相邻细胞之间的信号传导,而自分泌信号通路涉及从细胞到自身的信号转导。
  • 内分泌信号 通路涉及通过血流将信号传输到全身。

无论涉及的信号通路类型如何,细胞信号转导都使细胞能够协调其活动并对环境变化做出适当响应。这一过程对于维持体内稳态至关重要,可确保细胞以协调和高效的方式发挥其各种功能。

AKT 通路是最广泛研究的,具有显著相关性 的信号通路之一,因为它在调节细胞生长,存活和代谢方面发挥着关键作用。AKT 通路由各种细胞外信号激活,包括生长因子,激素和细胞因子。一旦激活, AKT 通路可调节多种细胞过程,包括葡萄糖代谢,蛋白质合成和细胞增殖的调节。该方法通过磷酸化各种下游靶标 (包括 mTOR 复合物和糖原合酶激酶 3 (GSK3) (图 1) 来实现这一点。

Graphic of the Akt signaling cascade with the involved proteins

图1.AKT 信号通路。AKT 信号转导通路通过胰岛素或胰岛素生长因子 (IGF) 等生长因子活化,促进类似 IGF-1R 的相应受体酪氨酸激酶 (RTKs) 磷酸化,通过 IRS-1 , AKT , GSK-3 β , mTOR 或 CREB 等下游靶标磷酸化增殖进一步信号转导,以调节与肿瘤发育相关的细胞过程,包括细胞凋亡,基因转录,细胞周期进展和细胞代谢调节子。

通用的检测方法

研究细胞信号通路的最常用技术之一是使用生化和蛋白检测。这些检测涉及细胞组分的分离和操作,以研究通路内特定信号分子的活化和调节。

检测的示例包括:

  • 免疫印迹和 Western 印迹 (或 Western 印迹) ,可用于检测和定量特异性蛋白
  • 可用于研究蛋白 - 蛋白相互作用的免疫沉淀
  • 酶活性检测,用于测量信号转导通路中涉及的酶的活性
  • ELISA (酶联免疫吸附测定) ,用于测量特定蛋白浓度
  • 多重检测,如 ProcartaPlex ,后者使用基于微球的技术同时定量多个蛋白质
     

表 1. 某些选定检测的比较表。

 

免疫印迹ELISAProcartaPlexProcartaPlex
双报告
适用于蛋白验证,确认和目视鉴定具有特异性和灵敏度的单靶点分析高通量,用更少的样品分析更多的生物标志物多通路检测并测量同一蛋白的两个参数
样本类型多种 (例如裂解物和纯化蛋白)多种 (细胞和组织裂解物,血浆,血清,其他体液,细胞培养物上清液, 等)
蛋白质形式变性天然分子
需要提取蛋白
定量半 / 相对 定量定量;通过校准曲线 

检测范围

低至中等浓度低至高浓度
蛋白质大小分子量蛋白的大小分离和测定没有有关蛋白大小的信息

多重标记

多达 4-Plex 荧光多重检测或联排分析和重新检测化学发光检测多达80个反应8 种分析物的多达 2 个参数

ELISA 和微球检测

ELISA 和基于微球的多通路检测是研究细胞信号通路的广泛使用的工具。使用免疫检测的主要原因是其灵敏度,特异性,简单的实验方案和高通量能力。此外, ELISA 和 ProcartaPlex 测定均与其他传统实验室方法 (如 Western 印迹) 高度相关。通过利用 ELISA 和 ProcartaPlex 检测,研究人员可以阐明细胞信号通路的复杂机制,从而促进旨在解决多种疾病的创新治疗干预方法的发展。

表 2. 重点介绍用于研究细胞信号的免疫学测定的出版物列表。

磷酸化特异性 ELISA 试剂盒

磷酸化状态异常与癌症等许多人类疾病有关。研究关键蛋白质靶标的磷酸化和翻译后修饰对于更好地理解疾病背后的机制至关重要。我们提供磷酸化特异性 ELISA 试剂盒,用于检测许多与多种疾病相关的关键靶标和信号通路(包括 STAT3、CREB、PRAS40、p38、AMPKα、PTK2 和胱天蛋白酶 3 信号传送)的磷酸化状态。这些试剂盒有两种不同的形式——标准 ELISA 和 InstantOne ELISA 试剂盒。这两种试剂盒都有助于确保出色的检测结果和重现性。试剂盒必须满足灵敏度、动态范围、精度、特异性、回收率和批间一致性的质量控制规范。

检索 ELISA 试剂盒

常见研究蛋白靶标和 ELISA 试剂盒性能数据

表3.查看用于检测以下常见磷酸化靶标的赛默飞 ELISA 试剂盒:

预包被磷酸化 ELISA 试剂盒

Invitrogen 预包被磷酸化 ELISA 试剂盒使用标准 ELISA 形式,包括预包被捕获抗体 (靶标特异性) ,其中依次加入样品或标准品和检测试剂。这些试剂盒配有蛋白标准品,可生成定量结果的标准曲线,设计用于检测和定量细胞裂解物中的磷酸化蛋白。图 2 显示了 Jurkat 细胞中的总 AKT 和 AKT [pS473] 的水平,并证明了 AKT 磷酸化和 PI-3 激酶活之间的关系。预包被磷酸化 ELISA 试剂盒的特异性已通过肽竞争试剂盒检测得到证实 (图 3) ,而分析灵敏度是通过比较蛋白质印迹和 ELISA 与已知数量的磷酸化蛋白 (如 AKT [pS473]) 来测定。

预包被磷酸化 ELISA 试剂盒的优势

  • 定量——获取定量数据以补充蛋白质印迹图像
  • 特异性——两种针对分析物的抗体具有比蛋白质免疫印迹法更好的特异性
  • 灵敏度——比蛋白质免疫印迹法更灵敏,通常只需要 2,000-3,000 个细胞
  • 中等处理量——96 孔形式,4 小时得出结果,不需要密度测定分析
AKT-in-jurkat-cells-1200x638

图2:使用 AKT ELISA 测量 Jurkat 细胞中总 AKT 与磷酸化 AKT 的测量。 将 Jurkat 细胞的渥曼青霉素 (一种 PI-3 激酶抑制剂) 浓度增加 (0~500 nm) ,用于 Jurkat 细胞的处理。用 AKT (Total) Human ELISA 试剂盒 (货号 2373) 裂解细胞,并同时检测 AKT [Total ] 和磷酸化 AKT [pS473] 的情况号  人源 KHO0101) 和 AKT (磷酸化) [pS473] ELISA 试剂盒 (货号. KHO0111) .图表显示,总 AKT 数量保持相当,然而,丝氨酸 473 的磷酸化水平以剂量依赖性方式降低,渥曼青霉素增加。

specificity-of-AKT-ELISA-1200x825

图3.AKT [pS473] ELISA 的特异性。 进行肽竞争检测,以确认 AKT [pS473] 的特异性。用 AKT (Phospho) [pS473] Human ELISA 试剂盒 (货号 KHO0111)。该图显示,只有对应于丝氨酸 473 周围区域的肽才会阻断 ELISA 信号。

sensitivity-of-AKT-ELISA-1200x243

图4.AKT [pS473] ELISA 的分析灵敏度。 Jurkat 细胞在最佳条件下培养,并获得磷酸化 AKT 细胞提取物。在细胞裂解物中使用 AKT (磷酸化) [pS473] Human ELISA 试剂盒 (货号 KHO0111) 和 Western Blot。AKT [pS473] ELISA 的分析灵敏度通过在 30 次检测内获得的平均外径上增加两个标准差来确定。数值 <0.8 单位 /mL 对应于从 4000 个 Jurkat 细胞中提取的 AKT [pS473] 的量。结果显示,根据已知量的 AKT [pS473] 进行检测时, ELISA 的灵敏度是 Western 印迹的 ~2 倍。

Invitrogen InstantOne 磷酸化 ELISA 试剂盒

Invitrogen InstantOne 磷酸化 ELISA 试剂盒包含传统 ELISA 中使用的所有试剂,加入 InstantOne 检测板的溶液中。这些试剂盒具有精简的工作流程,其中靶标分析物可结合两种溶液中的夹心 ELISA 抗体,而捕获抗体通过专有机制与板结合。这些检测板可快速分析样品,实现简单的一次清洗方案。使用 3 , 3' , 5 , 5'- 四甲基联苯胺 (TMB) 比色底物进行特定分析物的检测。

这些试剂盒设计用于准确测量细胞裂解物中的总蛋白和 / 或磷酸化蛋白。InstantOne 检测已通过 ELISA 验证,可检测多种关键靶标,包括 NF- kb , p38 MAPK(图 5) , SMAD1 (图 6) ,并且通过免疫印迹分析评估特异性。

包被 InstantOne 磷酸化 ELISA 试剂盒的优势:

  • 灵活性—能够在单个板上检测单个蛋白的总水平和/或磷酸化蛋白水平
  • 特异性—两种针对分析物的抗体提供比 western 印迹更好的特异性
  • 灵敏度—比 western 印迹更灵敏,通常只需要 2,000-3,000 个细胞
  • 高通量—1 小时和 1 次洗涤方案
p38-MAPK-pT180-pY182-in HEK293-cells-1200x488

图 5.使用 InstantOne ELISA 检测 HEK293 细胞中的人 p38 MAPK [pT180/pY182]。 HEK293 µg 用 2 μ g/mL 茴香霉素 (p38 /JNK MAPK 通路的有效激活剂) 处理 30 分钟 未处理的 HEK293 细胞 (-) 用作阴性对照。通过 Western 印迹 (右) 和 ELISA (左) 用 gp38 MAPK (磷酸化) [pT180/pY182] 多物种 InstantOne ELISA 试剂盒 (货号No. 85-86022-11).通过免疫印迹检测到 38 kDa 条带的强度与 InstantOne ELISA 吸收值有关。

total-and-phosphorylated-SMAD1-i- C2C12-cells-1200x573

图 6.使用 InstantOne ELISA 检测 C2C12 细胞中的 SMAD1 (总 / 磷酸化)。 C2C12 细胞要么被染色体丙型 (50 mM) 抑制 60 分钟) (-) ,要么被 BMP4 (10 ng/mL) 刺激 30 分钟 (+)。裂解物按照 InstantOne ELISA 用户手册中的说明制备。µg  SMAD1 (10 μ L/ 检测) 或磷酸化 SMAD1 [S463/S465] (右) 检测总 SMAD1 (总 / 磷酸化) InstantOne ELISA 试剂盒 (货号No. 85-86183-11).

细胞信号 ProcartaPlex 多重免疫测定

ProcartaPlex 是一种基于 Luminex 微球的多重免疫检测,可在单个孔中同时定量多个分析物。可同时定量测定总蛋白和 / 或磷酸化蛋白形式。这有助于揭示研究细胞信号通路中复杂的相互作用。

从我们专为测量总蛋白或磷酸化蛋白而设计的经典 ProcartaPlex 形式中选择,或发现用于 Luminex xMAP INTELLIFLEX DR-SE 仪器的新型 ProcartaPlex 双报告分子检测,其具有独特的功能,可以在同一个微球上同时定量多达 8 种蛋白的磷酸化和总形式 (表 4)。

ProcartaPlex 细胞信号测定的优势:

  • 可比性—可获得与 ELISA (图 7) 和 Western 印迹分析 (图 8) 相当的结果,并且多通路技术具有额外好处
  • 动态范围宽且灵敏度增强—即使是低丰度蛋白质和信号分子也可以进行检测 (图 9)
  • 双报告基因多重—可在单个孔中同时检测同一微球上的多种磷酸化蛋白和总蛋白 (图 10)

这种多重检测功能可节省时间和宝贵的样品材料,有助于更有效地获得全面的数据。与 ELISA 和 Western 印迹相比,多重检测手动操作时间更短,通量更高,可显著提高信号研究的效率。

表 4. ProcartaPlex 细胞信号检测有多种规格。

 

ProcartaPlexProcartaPlex Dual Reporter
总蛋白(仅限)x
磷酸化蛋白 (仅限)x

总蛋白和磷酸化蛋白 *

x
多重,适用于细胞信号最多8个最多16个
(8 种分析物的 2 个参数)
板规格96孔96孔
Luminex 仪器xMAP INTELLIFLEX 和 xMAP INTELLIFLEX DR-SE 系统
FLEXMAP 3D 系统
Luminex 200 系统
MAGPIX 系统
xMAP INTELLIFLEX DR-SE系统
上样量25 μL 预稀释的裂解物25 μL 预稀释的裂解物
读取时间4 小时4 小时
检测规格
预混 Panel
混合与匹配
单因子试剂盒x

工作原理:

Schematic images of the ProcartaPlex and ProcartaPlex Dual Reporter assay designs

A) 对于 ProcartaPlex 测定, Luminex 微球与特异性结合信号转导蛋白的捕获抗体偶联,无论其磷酸化状态如何。特异性抗体与不同微球编码的偶联能够在单个孔中分析多种分析物。创建单独的检测组合,用于使用不磷酸化特异性或磷酸化特异性检测抗体和 PE 染料针对报告通道 1 (532nm) 对总信号蛋白或磷酸化信号蛋白进行多通路分析,使其与所有 Luminex 仪器兼容。

(B) 对于 ProcartaPlex 双报告基因测定,应用相同的捕获抗体,但用于定量磷酸化信号转导蛋白使用磷酸化特异性检测抗体 (带有 BV421 偶联) ,它利用 Luminex xMAP INTELLIFLEX DR-SE 仪器的额外报告通道 2 (405 nm)。使用 PE 染料通过报告通道 1 (532 nm) 检测总蛋白。该方法可同时定量在同一微球上单个孔中的总蛋白和磷酸化蛋白。

多重细胞信号通路的优势

蛋白免疫印迹是一种用于鉴别和检测蛋白质靶标及其翻译后修饰状态的常用技术。蛋白免疫印迹技术的简单性和灵活性特别适用于基础工作和验证。然而,在细胞信号研究中,对多种蛋白进行分析的需求及其磷酸化状态通常与大量样品结合在一起。这一事实使多重分析成为该研究领域的一个有价值工具,它允许在单个样品中同时定量多种分析物,同时节省时间,样品体积和实现高通量。多重检测方案类似于 ELISA 检测。ProcartaPlex 检测显示与 ELISA (图 7) 和蛋白质免疫印迹 (图 8) 有较高的相关性,且显示出出色的灵敏度 (图 9)。此外,创新的 ProcartaPlex Dual Reporter 检测试剂盒可在单个孔中同时定量分析同一个磁珠上的总蛋白和磷酸化蛋白 (图 10)。

ProcartaPlex 信号检测组合和性能数据

图7.比较数据显示了 ProcartaPlex 信号测定与传统 ELISA 的相关性。各种细胞系裂解物重复使用,并在 ProcartaPlex 信号转导 Simplex 试剂盒 (货号EPX010-97101-Pho,货号EPX010-97106-Pho,  货号EPX010-97102-Pho) 和 ELISA 试剂盒 (货号KHO0111,货号KHO0421,货号KHO0241)。  Akt [pS473] 、 PRAS40 [pT246] 和 CREB [pS133]  的测量浓度 数据显示高度相关性 (R2 > 0.8)。这表明, ProcartaPlex 信号单因子检测试剂盒可获得与传统 ELISA 试剂盒相当  的定量结果,并且该试剂盒具有多重技术的额外优势,包括减少样品量,缩短测定 / 手动操作时间以及降低每个数据点的成本。 

图8.ProcartaPlex 和蛋白质免疫印迹的比较数据。使用 Western 印迹和 ProcartaPlex 人 AKT 通路双报告基因检测组合 2x8plex (货号EPX080-97200-DR) 显示了两个检测系统之间的高相关性。Western 印迹数据显示,裂解 NIH-3T3 细胞中的 PRAS40 [pT246] 水平 (40 kDa)。10µg 定量的蛋白 (μ g) 用于蛋白免疫印迹和 ProcartaPlex 检测。ProcartaPlex 人 AKT 通路双报告基因检测组合, 2x8plex (货号按用户指南执行了 EPX080-97200-DR)。在蛋白质印迹分析中,使用 Bolt 4 至 12% , Bis-Tris , 1.0 mm ,小型蛋白凝胶 17 个槽 (货号. NW04127BOX)、XCell SureLock 电泳系统(货号 No. EI0002) and PageRulerPlus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa (Cat.号. 26619).然后将分离蛋白 转印到硝酸纤维素膜上 iBlot 2 转印膜组,硝酸纤维素膜 (货号 IB23002) 带 iBlot 2 干式印迹系统。使用 iBind Solution Kit(货 号 SLF1020)。使用 SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物(货 号. 34577)

图9.ProcartaPlex 信号检测和蛋白质免疫印迹的分析灵敏度比较。Jurkat 细胞在最佳生长条件下培养,并使用细胞裂解物测量磷酸化 CREB。µg 1 : 2 连续稀释用相同量 (10 μ g) 的蛋白,并使用 ProcartaPlex CREB [pS133] Simplex 试剂盒 (货号. EPX010-97102-Pho) 和 Western 印迹检测。对于 Western 印迹,使用相同的针对 PRAS40 [pT246] 的磷酸化特异性检测抗体,如 Simplex 试剂盒所含。µg 免疫印迹测定的最低浓度为 5 μ L/ 孔 µg ,使用 ProcartaPlex 单因子检测试剂盒测定的最低浓度为 0.6 μ L/ 孔。

图10.常规 ProcartaPlex 和 ProcartaPlex Dual Reporter 规格之间的相关性。ProcartaPlex Human Akt Pathway Dual Reporter Panel, 2x8plex (货号EPX080-97200-DR) 与 ProcartaPlex Human Akt Pathway Panel (total) , 8plex (货号EPX080-97000-901) 和 Akt Pathway Panel (phospho), 8plex (货号EPX080-97100-Pho) ,用于评估 AKT 信号转导通路中涉及的总蛋白或磷酸化蛋白。获得的数据表明,双报告基因 Panel 与总蛋白或磷酸化蛋白 (R2 > 0.9) 的常规检测组合之间存在强烈的相关性。

表 5.用于研究细胞信号转导的预混 ProcartaPlex 多重免疫检测组合。

用于定量总蛋白和磷酸化蛋白的双报告基因检测 panels
产品名称规格货号

靶标列表 [微球编码]:

AKT + Akt [pS473] [47] , CREB + CREB [pS133] [43] , GSK-3 β + GSK-3 β [pS9] [56] , IGF-1R + IGF-1R [pYpYpYpY1135/1136] [34] , IRS-1[ps312] [37] , PRAS40 + [pT2441] [pT2441]

96孔EPX080-97200-DR

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用于定量总蛋白的检测组合
产品名称规格货号

ProcartaPlex Human Akt Pathway Panel (total), 8plex

靶标列表 [微球编码]:

AKT [47] , CREB [43] , GSK-3 β [56] , IGF-1R [34] , IRS-1 [37] , mTOR [26] , PRAS40 [42] , p70S6K [27]

96孔EPX080-97000-901
检测组合用于磷酸化蛋白定量
产品名称规格货号

ProcartaPlex Human Akt Pathway Panel (phospho), 8plex

靶标列表 [微球编码]:

Akt [pS473] [47] , CREB [PS133] [43] , GSK-3 β [pS9] [56] , IGF-1R [pYpY1135/1136] [34] , IRS-1[pS312] [37] , mTOR [Ser2448] [26] , PRAS40 [pT246] , [pT246] , [pTpS421/424] [27]

96孔EPX080-97100-PHO

请注意:用于总蛋白的 ProcartaPlex Simplex 试剂盒可以彼此结合。用于磷酸化蛋白的单因子试剂盒也是如此。无法组合用于总蛋白和磷酸化蛋白的单因子试剂盒。如果您想要定量单个 panel 中的总蛋白和磷酸化蛋白,可以使用 ProcartaPlex Panel 选择工具来设计您的 Panel。然而,请务必注意,这些检测组合只能在 Luminex xMAP INTELLIFLEX DR-SE 仪器上运行。

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参考文献


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