核酸电泳注意事项-核酸电泳基础知识-赛默飞

如上节所讨论的实验装置，核酸电泳工作流程需要执行若干步骤，每一步都可能影响核酸分离的结果。本页面主要讨论与样品、试剂和运行参数相关的7大额外注意事项，包括:

核酸序列和构象
凝胶试剂性能
凝胶厚度和孔径大小
运行缓冲液类型
凝胶运行中的电压，电流和功率
核酸染色性能
凝胶染色方法

1. 核酸样品的序列和构象

电泳基本原理表明，不同大小的核酸样品，具有不同的迁移性。但是，在电泳过程中，具有相同数量核苷酸，不同序列组成和构象的核酸也可能有不同的迁移性(图1)。

序列在高分辨率的电泳中，富含AT的DNA可能比同等大小富含GC的DNA迁移速度慢。此外，大约每10个bp有4 - 6腺苷重复的DNA分子(被称为DNA卷曲)，将会出现不规则迁移，特别是在聚丙烯酰胺凝胶中[1,2]。其反常迁移可能是由于序列组成影响了分子构象所造成的。
构象： 在穿过凝胶孔时，序列相同但构象不同的DNA分子，如环状和线性质粒的迁移会受到各构象紧密性的影响。高度致密的超螺旋分子迁移速度最快，其次是柔韧的线性和开环分子(图1)。这种迁移速率的差异可用来检验质粒DNA 分离后的完整性，因为完整质粒DNA在譬如哺乳动物细胞转染基因过表达的应用中用处非常大。

图 1. 构象不同的相同DNA的电泳迁移。 (A) 带切口环状、线性、超螺旋质粒DNA的电泳。 (B) 松弛型环状、线性和超螺旋质粒DNA的构象。带切口质粒是一个松弛、开放的环状构象，体积大，凝胶中迁移缓慢；线性质粒迁移速度稍快；完好无损的质粒最紧凑，迁移速度最快。

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2. 琼脂糖和丙烯酰胺试剂的性能，可用作电泳的电泳相关属性

有关琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶的选择，主要取决于需分离核酸样品的大小和所希望达到的分辨率(了解更多有关两种凝胶的信息)。一般而言，高百分比凝胶适用于分离小分子，效果好。表1归纳了核酸电泳选择琼脂糖和丙烯酰胺凝胶试剂时需考虑的性能。

性能	影响
Clarity	琼脂糖形成半透明的凝胶。因此，在凝胶的可视化和文档化过程中，具有更高清晰度规格的琼脂糖可保证最小的荧光背景。
电渗透(EEO)	电泳过程中，缓冲液离子与琼脂糖基质表面及里面电荷分子之间的相互作用，会影响缓冲液向电极的移动，这一过程被称为电渗或EEO。由于缓冲液的正电离子(阳离子)与核酸(图2A)流动方向相反(图 2A)，而带有较高负电荷的琼脂糖则会影响阳离子的移动，从而影响大核酸分子的分离(>10kb)。 EEO值可视为琼脂糖中负电荷基团数量的间接表示。琼脂糖侧链上的氧原子(由图 2B中X表示)可携带氢(X = H)，或带负电荷的基团，如硫酸盐(SO₃^–)和丙酮酸(CH₃COCOO^–)。由于负电荷吸引缓冲液阳离子，琼脂糖上存在的这些基团则会降低核酸分离的效率和分辨率。
凝胶点	凝胶点指的是琼脂糖溶液形成凝胶时的温度。凝胶比例越高，凝胶点越高。
凝胶强度	凝胶强度用力单位(g/cm²)表示，指的是其抗破碎的能力，具体取决于琼脂糖浓度。凝胶强度越高，就越方便处理。
遗传质量	遗传质量(GQ)指出，琼脂糖是否适用于分子生物学主要根据污染物和酶抑制剂水平。
熔点	熔点指的是琼脂糖的融化温度。由于琼脂糖凝胶在受热时融化，所以熔点总是高于凝胶点。低熔点琼脂糖(LMP) 是一种特殊琼脂糖，融化温度(~ 25°C)明显低于其他标准琼脂糖。 LMP琼脂糖同时具有较低的凝胶点，非常适用于大型核酸提取和连接等胶内酶反应。

性能	影响
分子生物学	使用已进行核酸酶活性和污染物存在测试的高质量，分子生物级试剂。可保护电泳过程中核酸样品的完整性。
稳定性/保质期	商业上通常在聚丙烯酰胺原液中注入某种气体，以延长其稳定性。如果您在实验室自己制备聚丙烯酰胺原液，注意在几个月内使用完，否则其会随着时间推移分解为丙烯酸。丙烯酰胺和双丙烯酰胺粉末或溶液应储存于避光容器中，以免受光线影响。硫酸铵(APS)溶液最好是现配现用，用于形成自由基启动凝胶聚合。在4°C条件下，制备的原液可储存约一个月,但效率会随时间下降。四甲基乙二胺 (TEMED)是稳定凝胶聚合中形成的自由基试剂,应密封存储,以防止氧化。
总的单体含量，w/v (%T)	溶液中丙烯酰胺单体和交联双丙烯酰胺的总含量(% T)决定了聚丙烯酰胺凝胶的孔隙大小。例如，10%的聚丙烯酰胺凝胶由10% (w/v) 的丙烯酰胺和双丙烯酰胺组成。 %T越高，孔隙越小，分离小分子的分辨率也就越高(了解更多: 聚丙烯酰胺凝胶推荐%）。
交联剂的百分比(%)	%C是指交联剂量与单体总量的比例(w/w)。在指定%T中， %C越高，孔隙越小。 %C也指丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比值(例如，5 %C为19:1)。 5% C(19:1)和3.3% C(29:1)的聚丙烯酰胺凝胶为核酸电泳常用凝胶。

琼脂糖

性能	影响
Clarity	琼脂糖形成半透明的凝胶。因此，在凝胶的可视化和文档化过程中，具有更高清晰度规格的琼脂糖可保证最小的荧光背景。
电渗透(EEO)	电泳过程中，缓冲液离子与琼脂糖基质表面及里面电荷分子之间的相互作用，会影响缓冲液向电极的移动，这一过程被称为电渗或EEO。由于缓冲液的正电离子(阳离子)与核酸(图2A)流动方向相反(图 2A)，而带有较高负电荷的琼脂糖则会影响阳离子的移动，从而影响大核酸分子的分离(>10kb)。 EEO值可视为琼脂糖中负电荷基团数量的间接表示。琼脂糖侧链上的氧原子(由图 2B中X表示)可携带氢(X = H)，或带负电荷的基团，如硫酸盐(SO₃^–)和丙酮酸(CH₃COCOO^–)。由于负电荷吸引缓冲液阳离子，琼脂糖上存在的这些基团则会降低核酸分离的效率和分辨率。
凝胶点	凝胶点指的是琼脂糖溶液形成凝胶时的温度。凝胶比例越高，凝胶点越高。
凝胶强度	凝胶强度用力单位(g/cm²)表示，指的是其抗破碎的能力，具体取决于琼脂糖浓度。凝胶强度越高，就越方便处理。
遗传质量	遗传质量(GQ)指出，琼脂糖是否适用于分子生物学主要根据污染物和酶抑制剂水平。
熔点	熔点指的是琼脂糖的融化温度。由于琼脂糖凝胶在受热时融化，所以熔点总是高于凝胶点。低熔点琼脂糖(LMP) 是一种特殊琼脂糖，融化温度(~ 25°C)明显低于其他标准琼脂糖。 LMP琼脂糖同时具有较低的凝胶点，非常适用于大型核酸提取和连接等胶内酶反应。

丙烯酰胺凝胶试剂

性能	影响
分子生物学	使用已进行核酸酶活性和污染物存在测试的高质量，分子生物级试剂。可保护电泳过程中核酸样品的完整性。
稳定性/保质期	商业上通常在聚丙烯酰胺原液中注入某种气体，以延长其稳定性。如果您在实验室自己制备聚丙烯酰胺原液，注意在几个月内使用完，否则其会随着时间推移分解为丙烯酸。丙烯酰胺和双丙烯酰胺粉末或溶液应储存于避光容器中，以免受光线影响。硫酸铵(APS)溶液最好是现配现用，用于形成自由基启动凝胶聚合。在4°C条件下，制备的原液可储存约一个月,但效率会随时间下降。四甲基乙二胺 (TEMED)是稳定凝胶聚合中形成的自由基试剂,应密封存储,以防止氧化。
总的单体含量，w/v (%T)	溶液中丙烯酰胺单体和交联双丙烯酰胺的总含量(% T)决定了聚丙烯酰胺凝胶的孔隙大小。例如，10%的聚丙烯酰胺凝胶由10% (w/v) 的丙烯酰胺和双丙烯酰胺组成。 %T越高，孔隙越小，分离小分子的分辨率也就越高(了解更多: 聚丙烯酰胺凝胶推荐%）。
交联剂的百分比(%)	%C是指交联剂量与单体总量的比例(w/w)。在指定%T中， %C越高，孔隙越小。 %C也指丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比值(例如，5 %C为19:1)。 5% C(19:1)和3.3% C(29:1)的聚丙烯酰胺凝胶为核酸电泳常用凝胶。

图 2. (A)电泳过程中，缓冲液阳离子相对于核酸移动。 (B)琼脂糖结构单元氧的位置上，可携带负电荷基团(由X表示)。

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3. 凝胶厚度和孔径大小

凝胶厚度和孔径大小，包括琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶，也可影响电泳结果[3]。

一般而言， 较厚的凝胶 运行过程中产生热量也较多，可导致条带扩散。由于凝胶染色的高背景或凝胶染色和/或脱色所需时长(如进行电泳后染色 )，可能会出现可视化不佳的情况。对于琼脂糖凝胶，厚度以3 - 4 mm为佳，不推荐超过5 mm厚度的凝胶。聚丙烯酰胺凝胶的厚度由制造商提供的用于凝胶灌制的垫片决定，最常见的是0.75 mm,1.0 mm,1.5 mm。

而由胶梳形状决定的 孔径大小，不仅影响样品的装载量，而且会影响条带的分辨率。虽然较大的孔可容纳更大的样品负载，但同时也会产生粗条带，减少条带分辨率并产生污点。而长而窄的孔可容纳的样品量虽小，但可提供更清晰的条带，以获得更好的分辨率。减少高密度样品的进样量可提供更高强度的条带。

4. 运行缓冲液类型

核酸电泳中常用的两种运行缓冲液为 Tris-醋酸 EDTA (TAE)和 Tris-硼酸盐EDTA (TBE)[5](参见上节凝胶运行步骤)。低分子量样品(如DNA < 1000bp)用具有较高离子强度和缓冲能力的 TBE 缓冲液分离效果较好；较大的DNA片段在TBE缓冲液中分离效果不佳。用于分离生成二级结构的分子（例如RNA）的变性电泳，通常采用TBE缓冲液，因为聚丙烯酰胺凝胶主要使用添加了7-8 M尿素或类似变性剂的TBE缓冲液，以维持核酸的单链状态。

分离分子量较大(例如，DNA≥12-15 kb)的核酸,优先考虑低场强（1–2 V/cm)TAE 缓冲液。 TAE缓冲液可促进凝胶产生较大尺寸孔隙，减少电内渗 (为带电相对较少的缓冲液)，并降低电场强度，以降低大分子产生污点的趋势[6]。

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5. 运行参数:电压、电流、功率

通过电泳分离样品，施加电场后带负电荷的核酸向正极迁移。因此，电泳的电气参数可以影响样品的迁移和组成其片段的分辨率[7,8]。

根据欧姆定律推导出的下列方程，可用来展示电压(V)、电流(I)和功率 (P) 如何影响电泳结果。

电压=电流x电阻，即V = I x R
，功率=电流x电压，即 P = I x V
，因为V = I x R，功率也可表示为 P = I²x R。

在凝胶运行过程中，电阻(R)是系统的固定参数。例如，系统的缓冲液(电导率和缓冲能力)、温度、凝胶性能(百分比、高度、长度、数量、截面)等，都会影响电阻。在导电介质中，较高温度可允许更多的电流流动，所以温度升高电阻减小。。然而，在凝胶运行过程中，电阻可能会有所不同。

影响电泳的另一重要因素是热量。产生的热量与系统消耗的能量成正比，而且取决于缓冲液电导率、施加的电压和电阻。缓冲液的导电性越高(特别是由小离子组成)，电流越高。高电压和低电阻也可提高电流。整体电流的增加,增加了系统产生的能量和热量。

表2 描述了电阻和热如何影响恒压、电源和电流对电泳系统的影响。无论电源是否提供恒定电气参数，电压的上限应略低于系统的最大值，以避免过热导致设备和样品的损坏。一般建议设置可实现样品有效分离且不会产生过多热量的电气参数。

表 2. 核酸电泳的电压、功率和电流。

	电压（V）	功率（P）	电流（I）
描述	V = I x R 对应凝胶系统两个电极间的电位差	P = I x V or P = I² x R 测量能量转换速率—其与系统产生的热量有关	I = V/R 代表缓冲液离子的流动，与施加的电压直接相关
电泳的影响	电压影响电场强度(V/cm)。高电压，可加快带电分子移动。推荐使用恒压，以最大限度控制样品迁移速度。既定系统中，电压恒定(V = I x R)，电阻变化(例如，来自于不同数量和截面的凝胶)时电流相应减少或增加，以保持样品迁移速率相对恒定。	恒定功率可防止系统过热，但会导致样品迁移的不同。在凝胶长时间的运行过程中，缓冲液离子(减少电流)的损耗可能导致电压逐渐增加，以保持恒定功率(P = I x V)。蛋白质的等电聚焦(IEF) 是恒功率的典型应用。凝胶运行结束时，需逐渐增加电压，将样品“聚焦”到狭窄区域。	电流按2的数量级影响功率的大小(P = I² x R)。恒定电流可保持系统功耗和生成热量相对恒定(在核酸的连续非梯度凝胶中)。在非连续或梯度蛋白质凝胶电泳中，恒定电流可能对样品堆积有用。由于I = V/ R，当样品进入高百分比凝胶(电阻增加)时，为保持电流不变电压也应增加，此过程中对样品需施加更大的电场。

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6. 核酸荧光染料的共同特性

电泳中，荧光染料常用于核酸样品染色，使其可视化。除灵敏度外，染料的激发波长、结合亲和性、凝胶渗透速度等特性也可影响电泳的工作流程和应用 (表3)[9]。

表 3. 用于核酸染色的荧光染料的共同特性。

性能	影响
亲和力	染料的结合亲和力非常重要，因为染料与样品结合后荧光增强方便观察。一般而言，相对于单链分子（如RNA），核酸染料对双链分子(如DNA)具有更高的亲和力，因为它更容易与双链螺旋分子结合。对于RNA电泳而言，对单链分子具有较高亲和力的独特染料可以提高RNA检测的特异性和灵敏度。
变性剂的兼容性	尿素和甲酰胺为RNA电泳常用变性剂。在变性电泳中，应考虑变性剂对染料的抗淬灭作用，以提高有效性。否则，在染色前应先清洗去除变性剂。
动态范围	动态范围表示样品量线性检测发生的数量级。因此，具有更广动态范围的染料可更精确定量凝胶中的条带。
激发波长	较长的波长会产生较低的能量，因而对核酸的损害也较小。因此相较于紫外光激发，使用蓝光激发的染料更能保护样品的完整性。并会在下游应用中产生明显影响，例如克隆效率。
凝胶渗透	在使用电泳后染色的情况下，快速穿透凝胶的染料不仅可以缩短工作流程，而且还能更好地染色较厚和高百分比的凝胶。
内源荧光	低内源荧光染料在凝胶染色中具有较低的背景，提高检测的同时，避开脱色需要。
诱变	在核酸染色中使用的荧光染料通常因其相互作用而产生诱变。具有较低诱变性和非危险染料是更安全，也更方便处理。

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7. 染料与样品的结合:凝胶内和电泳后染色方法

核酸样品染色的两种常用方法，包括:

(1) 凝胶内，染色剂与凝胶(和运行缓冲液)相结合
(2) 电泳后，运行完成后，凝胶单独浸泡染色。

两种方法各有优劣势，如表4所示。

表 4. 凝胶内与电泳后染色的利弊。

方法	优势	注意事项
凝胶内染色	更便利工作流程更快所需染色更少	在长时间运行后，染色可能会消失染色剂只能使用一次可能改变样品迁移性
电泳后染色	提供更精确的分子大小分析允许重复使用染色液或多个凝胶同时染色	工作流程耗时长所需染色剂较多可能会产生较多有害废物

凝胶内染色 更方便，可视化只需较少染料。然而，带正电的染色剂与核酸的迁移方向相反，会影响低分子量样品的检测，特别是在长时间运行的情况下(图 3A)。此外，与核酸结合的染料会改变样品的迁移，即凝胶迁移，导致样品的大小与实际不符(图 3B)。此外，在凝胶中加入高水平嵌入染料可能会改变超螺旋质粒DNA的构象，改变其在电泳中的迁移性(表观分子量)[10]。

因为 电泳后染色不影响样品的检测，是准确测定样品大小的首选方法。然而，该方法工作流程时间较长，所需染料较多，使用如溴化乙锭等染料时也会产生更多的有害废物。

图 3. 用嵌入染料进行核酸凝胶电泳的结果。(A) 在凝胶中加入的溴化乙锭与核酸的移动方向相反。黄线标志着溴化乙锭荧光背景和染料被耗尽的凝胶区域之间的边界。 (B) 一种大型的嵌入染料，被加入凝胶中而不是应用于电泳后染色时，会影响样品条带的迁移。为说明这种影响，两个分子量标准在两个凝胶中并排运行。高分子量的分子量标准(1列)在两种凝胶中都有相似的迁移(蓝线标示参考条带，显示条带位置)。在电泳过程中，低分子量的分子量标准(2列)在含有染料的情况下迁移不同。

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综上所述，在电泳中除工作流程设置外，选择合适的试剂、参数和方法，对实现最佳核酸分离和分析至关重要。

核酸电泳注意事项