| 可能原因 | 建议 |
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| 凝胶准备 |
| | - 确保将足量样品上样到凝胶中。在凝胶电泳中，每个条带通常需要几纳克样品，才能使其可见；因此，每1毫米的凝胶孔宽度通常推荐0.1–0.2 μg样品的用量。
- 使用具有深孔的凝胶梳子来改善少量样品的可视化。
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| 样品降解 | - 确保选择的试剂是分子生物学等级 ，并且实验室器皿不含核酸酶。处理核酸时，遵守良好的实验室操作规范（如，佩戴手套、防止核酸酶污染、在指定区域内操作等），特别是在处理RNA时。
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| 上样染料掩盖目标条带 | |
| 凝胶电泳运行 |
| 凝胶超限运行 | |
| 电极反接 | |
| 样品可视化 |
| 染色灵敏度低 | |
| 染料背景高 | - 对凝胶进行脱色，或选择具有低固有荧光的染料来省去脱色步骤。
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| 染色不均匀 | - 如果样品仅部分可见或仅在凝胶上的某些泳道内可见：
- 若采用胶内染色法，应在制备凝胶时将染色剂与琼脂糖溶液充分混匀（避免起泡）。
- 若采用电泳后染色法，应确保凝胶完全浸没在染色液中，并轻轻摇动一定时间。
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| 光源错误 | - 如果使用荧光染料进行染色，请检查其激发波长以确保使用的光源对激发染料进行可视化来说是适合的。
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| 可能原因 | 建议 |
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| 凝胶制备 |
| | - 灌注水平琼脂糖凝胶时，确保凝胶厚度在3-4 mm之间。凝胶厚度若超过5 mm，则可能会导致条带在电泳过程中扩散。
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| 上样孔形成不佳 | - 灌注凝胶前，应适当清洁凝胶梳。
- 为防止样品从凝胶底部泄漏和样品条带拖尾，切记不可将凝胶梳一直推到水平凝胶的底部。
- 不可将凝胶槽填充过满，否则会导致上样孔连接。
- 移除凝胶梳之前，应预留足够的上样孔形成时间。
- 凝胶凝固后，小心平稳地移除凝胶梳，防止上样孔损坏。
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| 凝胶类型错误 | - 对于单链核酸（例如RNA）的电泳，制备用于有效分离的变性凝胶 ,但对于双链DNA样品的电泳，应避免使用变性凝胶。
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| 样品制备 |
| 样品超载 | - 在凝胶电泳中，不可使用过量样品；每1毫米的凝胶孔宽度通常推荐0.1–0.2 μg的样品用量。而拖尾、弯曲或U形条带以及融合条带均是过载凝胶的常见表现。
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| 样品降解 | - 确保选择的试剂是分子生物学等级 ，并且实验器皿不含核酸酶。处理核酸时，遵守良好的实验室操作规范（如，佩戴手套、防止核酸酶污染、在指定区域内操作等），特别是在处理RNA时。
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| 样品溶于高盐缓冲液 | - 检查加载缓冲液的盐浓度是否与选定的凝胶兼容。如有需要，可稀释上样缓冲液。
- 如果核酸样品已经溶于高盐缓冲液，则在添加上样缓冲液前使用不含核酸酶的水稀释样品。如果需要，纯化或沉淀核酸样品并将其重悬于无核酸酶的水中以除去过量的盐。
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| 样品含有大量蛋白质 | |
| 上样缓冲液不合适 | - 对于单链核酸的电泳，使用含有的变性剂的上样染料，然后加热样品，以防止形成不需要的双链体。
- 对于双链DNA的电泳，不可使用含有变性剂的上样染料和加热样品，以保护双链结构。
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| 凝胶电泳运行 |
| 气泡 | - 为避免条带变形，上样期间应确保气泡不会滞留在孔中。
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| 上样时损坏上样孔 | |
| 样品孔含有残留丙烯酰胺或尿素 | - 使用聚丙烯酰胺凝胶时，应在上样前将孔内的残留丙烯酰胺（和尿素，在使用变性凝胶的情况下）冲洗掉。
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| 电压过低或过高 | - 根据推荐施加电压为核酸的大小范围和使用的运行缓冲液。电压过低或过高，都无法实现最佳的核酸分离。
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| 电泳时间过短或过长 | - 足够长的运行凝胶以确保充分分离条带。但电泳时间不宜过长，否则会导致过度加热、样品变性和条带扩散。以确保充分分离条带。但电泳时间不宜过长，否则会导致过度加热、样品变性和条带扩散。
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| 电泳缓冲液不合适 | - 确保凝胶制备和电泳缓冲液相匹配，并采用正确的方法制备。
- 使用能够支持2小时以上电泳的强力缓冲液。
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| 样品可视化 |
| 条带扩散 | - 不可储存凝胶或在电泳完成和凝胶显色之间长时间放置凝胶。否则小分子成分的条带以及凝胶中的核酸染料会发生扩散。
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| 共迁移条带 | |
| 相机失焦 | - 如通过镜头观察凝胶并使其呈现在屏幕上，应确保相机对焦。
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| 可能的原因 | 建议 |
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| 凝胶准备 |
| 不适合的凝胶浓度 | - 确保凝胶浓度适用于解析所需含量的样品。小分子成分需采用高凝胶浓度。
- 制备琼脂糖凝胶时，需在煮沸后加水调整凝胶体积，以补偿蒸发的水分并防止凝胶浓度高于预期。
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| 未选择适合的凝胶类型 | - 选择更适合分离样品的凝胶类型。推荐使用聚丙烯酰胺凝胶来解析核苷酸<1,000 bp。
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| 上样孔不佳 | - 灌注凝胶前，应适当清洁凝胶梳。
- 为防止样品从凝胶底部泄漏，切勿将凝胶梳一直推到凝胶底部。
- 不可将凝胶槽填充过满，否则会导致上样孔连接。
- 移除凝胶梳之前，应预留足够的上样孔形成时间。
- 凝胶凝固后，小心平稳地移除凝胶梳，防止上样孔损坏。
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| 凝胶类型错误 | |
| 样品制备 |
| 样品超载 | - 在凝胶电泳中，不可使用过量样品；每1毫米的凝胶孔宽度通常推荐0.1–0.2 μg的样品用量。而拖尾、弯曲或U形条带以及融合条带均是过载凝胶的常见表现。
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| 样品含有大量蛋白质 | - 存在于样品中的蛋白质可能会干扰凝胶中的样品迁移。通过纯化样品来去除蛋白质，或者通过在上样前用含SDS的上样染料和加热来制备样品进行解离/变性蛋白质。
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| 上样缓冲液不合适 | - 对于单链核酸（例如RNA）的电泳，使用含有变性剂的上样缓冲液，然后加热样品 ，以防止形成不希望的双链体。
- 对于双链DNA的电泳，不可使用含有变性剂的上样染料和加热样品，以保护双链结构。
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| 样品体积过少 | - 为避免条带弯曲，应确保样品体积至少达到孔体积的30%。
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| 凝胶电泳运行 |
| 上样过程中引入气泡 | - 为避免条带变形，上样期间应确保气泡不会滞留在孔中。
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| 上样时损坏上样孔 | |
| 样品孔含有残留丙烯酰胺或尿素 | - 使用聚丙烯酰胺凝胶时，应在上样前将孔内的残留丙烯酰胺（和尿素，在使用变性凝胶的情况下）冲洗掉。
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| 电压过低或过高 | - 施加电压为建议的核酸的大小范围和使用的运行缓冲液。电压过低或过高，都无法实现最佳的核酸分离。
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| 电泳时间过短或过长 | |
| 电泳缓冲液不合适 | - 确保凝胶制备和电泳缓冲液相匹配，并采用正确的方法制备。
- 确保使用的缓冲液适用于要分离的样本。例如：
- TAE缓冲液在短期内更适合分离大片段（>1,500 bp）。
- TBE对于更短的片段（<5,000 bp）更好，但可能会减缓线性dsDNA的迁移。
- 使用能够支持2小时以上电泳的高缓冲能力缓冲液。
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| 可能的原因 | 建议 |
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| 凝胶制备 |
| 不均匀的凝胶浓度 | - 制备凝胶时，确保充分混合基质溶液。煮沸琼脂糖凝胶后，不应剩余任何未溶解的粉末或未融化的固体。
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| 凝胶不平整或上样孔倾斜 | - 将凝胶槽放在平坦表面上，灌注凝胶并插入梳子。凝胶梳应完全垂直插入凝胶表面，与凝胶上边缘平行，并在凝胶凝固过程中保持稳固。
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| 凝胶缓冲液不合适 | |
| 样品制备 |
| 包含不同构象的样品 | - 质粒DNA的不同构象（例如超螺旋，线性，松弛/切口）在电泳中显示出不同的迁移率。
- 在质粒DNA的电泳中，不可使用过多嵌入染料，以免改变质粒的构象。
- 当使用RNA等单链核酸时，在样品缓冲液中加入变性剂，并在凝胶上样前加热样品以保持单链。
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| 样品含有特殊序列 | - 富含AT的DNA在高分辨率电泳中的迁移较慢。
- “弯形”DNA（大约每10 bp含有4-6个腺苷酸重复序列）在聚丙烯酰胺凝胶上的迁移不规律。
- 修饰DNA（如，甲基化，或使用生物素或大荧光分子标记）的迁移速度比具有相同碱基对长度的未修饰DNA慢。
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| 样品具有粘性末端 | |
| 蛋白质与核酸结合 | |
| 凝胶电泳运行 |
| 不兼容的电泳缓冲区 | - 确保凝胶制备和电泳缓冲液相匹配，并采用正确的方法制备。
- 确保使用的缓冲液适用于需要分离的样本。例如：
- TAE缓冲液在短期内更适合分离大片段（>1,500 bp）。
- TBE对于较短的片段（<5,000 bp）更好，但可能会减缓线性dsDNA的迁移。
- 使用能够支持2小时以上电泳的高缓冲缓冲液。
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| 电压过高 | - 避免使用超过推荐的电压，因为它可能导致过热，样品变性和“微笑”带。
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| 加热过度 | - 确保运行缓冲液具有高缓冲能力，在长期运行（>2小时）期间循环/补充缓冲液，并在适当时冷却凝胶设备。
- 降低电压，或设置电流或功率恒定。
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| 样品可视化 |
| 染色与样品结合 | - 当使用大荧光染料时考虑电泳后染色，因为染色与核酸的结合可能在电泳过程中改变样品迁移率。
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| 可能的原因 | 建议 |
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| 样本准备 |
| 不准确的分子量标准品 | |
| 样品和分子量标准品使用的上样染料不同 | - 为获得可靠的定量数据，样品和分子量标准品应使用相同的上样染料
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| 样品可视化 |
| 所选分子量标准品的波段不正确 | |
| 强度测量不恰当 | - 为获得更精确的强度测量，应从目标条带的测量值中减去凝胶背景。如果有的话，使用凝胶成像仪的内置凝胶电泳图像分析软件。
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| 染色不均匀 | - 确保荧光染色剂与凝胶或染色液充分混匀。
- 确保凝胶完全浸没在染色液中。
- 对于较厚或高百分比凝胶，应延长染色时间，以确保荧光染料充分渗透。或者，考虑使用更快渗透特性的染料。
- 对于变性凝胶，应清洗凝胶以除去变性剂，防止荧光染色剂淬灭。或者，考虑一种耐普通变性剂淬灭的染料。
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a. 样品滞留在凝胶孔内
| 可能的原因 | 建议 |
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| 样本准备 |
| 过载样品 | - 在凝胶电泳中，不可使用过量样品；每1毫米的凝胶孔宽度通常推荐0.1–0.2 μg的样品用量。样品过量会导致样品滞留在凝胶孔中。
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| 样品中的蛋白质和细胞残骸 | |
| 凝胶电泳运行 |
| 没有电源 | - 确认电源开启/运行，并连接至电泳槽。
- 当电泳开始时检查电泳室中浸没的电极上的气泡是否上升（指示当电流流动时电极处的 有气体产生）。
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| 电泳缓冲液不合适 | - 确保电泳缓冲液与凝胶制备缓冲液匹配，制备方法正确，并且可传导。
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b.电泳后发生序列突变
c. 上样后样品漂浮
| 可能的原因 | 建议 |
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| 样本准备 |
| 上样缓冲区不正确 | |
| 样品溶液不合适 | |
d. 凝胶中存在斑点
| 可能原因 | 建议 |
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| 样品可视化 |
| 荧光污染物 | - 灰尘或凝胶中的某些微生物可能会发出荧光并产生斑点。使用分子生物学级别的试剂和清洁专用的实验室器具来准备凝胶。
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