核酸凝胶电泳原理和技术简要概述-赛默飞

生命科学的大多数研究人员在其职业生涯的某个阶段都会“使用凝胶”。为了运行凝胶，在基质上施加电场，生物分子（如核酸和蛋白质）可以通过它们的差异迁移率分离，迁移率取决于它们的相对大小，电荷和结构。典型的凝胶基质起到分子筛的作用，可阻碍生物分子由于电场力引起的迁移。该过程被称为 凝胶电泳，字面解释即为电流携带穿过凝胶。核酸凝胶电泳如何运行，相关技术经过怎样的构思?

本页内容：

基本原理
历史概述
参考文献

凝胶电泳分离核酸的基本原理

凝胶电泳是分子生物学中鉴定、量化和纯化核酸的常用实验技术。因其速度、简便性和通用性，该方法广泛应用于核酸的分离和分析。采用凝胶电泳法，可在几分钟到数小时内分离出约0.1 - 25 kbp范围内的核酸，且可高纯、高效地从凝胶中回收分离的核酸[1,2]。

该项技术主要，在大小、电荷和结构的基础上，将电场施加于带电分子混合物上并引起迁移。中性至碱性pH值(图1A)范围内，核酸中核苷酸骨架上的磷酸基团带负电。因此，每个核苷酸携带一个净负电荷，即，一个核酸分子的总电荷与核苷酸的总数或它的质量成正比。换言之，DNA或RNA分子的荷质比是恒定的。因此，它们在凝胶电泳中的迁移率主要取决于其大小（结构可比较时）（详细了解核酸结构如何影响迁移）。因此，当受到电场作用时，核酸从负极（阴极）向正极（阳极）迁移，较短的碎片比较长的碎片移动得更快，导致基于尺寸的分离（图1B ）。

图 1. (A) 核酸链携带的净负电荷。 (B) 凝胶电泳中不同长度的核酸片段分离。

此外，凝胶电泳中核酸的迁移距离通常与其大小具有可预测的相关性，从而能够计算给定样本中核酸的大小。对于线性双链DNA片段，在一定范围内，迁移距离与分子量的对数成反比(图 2A)[3]。对于近似大小，迁移距离通常与已知大小分子的样品进行比较(分子量标准品，有时被称为“分子量标准”)，该样品通常也参与凝胶电泳过程。被广泛接受、核酸通过凝胶迁移的模型为“偏爬行”模型——偏移偏向于施加的电场力，并成蛇形运动—前面部分拉动其余部分(图 2B)[4,5]。该模型已通过荧光显微镜观测[6]。

图 2. 凝胶电泳中核酸的迁移性。 (A) 线性双链DNA片段大小和迁移的相关性。 (B) 偏爬行模型。

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核酸凝胶电泳简史

电泳分离核酸技术，始于20世纪60年代初。那时，核酸主要基于沉积速度通过密度梯度离心法进行分离，分离情况由核酸的大小和构象决定。密度梯度离心法不仅过程耗时，且需重型设备和大量的样品投入。为寻求突破，研究人员开始探索电场作用下离子或电解液中DNA移动的特征—即电泳的过程[7,8]。

几年时间，通过借鉴已经在蛋白质电泳中使用的技术，核酸电泳进一步发展，开始使用凝胶基质作为分离介质。经过20世纪60年代中后期的进一步探索，琼脂(一种天然碳水化合物)，琼脂糖(一种琼脂成分)，聚丙烯酰胺(一种合成凝胶)，以及琼脂糖 -丙烯酰胺复合凝胶成功成为DNA和RNA电泳的基质[9 - 11]。早期凝胶电泳实验的分离结果表明了，密度梯度离心分离法(早期确定的核酸分离方法)中沉积系数或 S 值的相关性。随着20世纪60年代后期对琼脂糖生产的进一步了解和发展，琼脂糖逐渐取代琼脂成为首选凝胶电泳介质[12]。

图 3. 核酸凝胶电泳的早期发展时间表。

20世纪70年代，发现限制性内酶及其在重组DNA技术中的应用后，采用凝胶电泳分离和分析核酸变得更加普遍。那时，蔗糖密度梯度离心法为常用分离方法，但其过程繁琐，且不能充分区分限制内切产生的大小相似的DNA片段。因为从大到小片段的DNA内切会导致溶液粘度减小，所以溶液粘度是经验上限制性内切成功的指标[13]。 1971年，Danna和Nathans首次报道了利用聚丙烯酰胺凝胶电泳 对限制性内切的SV40 DNA片段进行分级[14]，DNA片段克隆因此发生发生革命性变化。 20世纪60年代后期，虽然琼脂糖和琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶已用于分离RNA和单链DNA[15,16]，但在1973年前并未出版琼脂糖凝胶电泳分析限制内切片段的研究(图 3)[17,18]。

20世纪70年代，采用凝胶电泳测定核酸也取得了重大突破。早期电泳方法依赖于核酸的放射性标记，以使分离分子可视化。尽管高度灵敏，但是放射标记过程较长，且需要辐射安全方面的培训。 1972年，两个实验室各自对用荧光分子 溴化乙锭 (EtBr)染色的凝胶进行了阐述，此后便成为了常见、简单的核酸测定方法，其灵敏度可达几毫微克的双链DNA[19 - 21]。现今，荧光染料比EtBr 更安全、更灵敏、更特异，进一步提高了核酸的测定。

随着EtBr的引入，凝胶电泳在1970年前后“平板”凝胶出现后，应用更加广泛，成为当今研究与设备的基石。早期的凝胶电泳研究，将 管中的凝胶 灌制到直径1-3毫米的玻璃管中。该法产出极低，因为每个管只能容纳一个样品(图 4A)。而垂直板凝胶 (图4B)，准备更加简单，允许多样品同时运行，并于20世纪60年代后期首次引入聚丙烯酰胺，在20世纪70年代早期(22 - 24)由研究人员进一步改进。 1977年首次由McDonell等人推出的琼脂糖水平板 (图 4C)凝胶(图4C)，与今天仍然使用的形式非常接近。[25] 今天，在聚丙烯酰胺和琼脂糖中都可使用迷你预制、即用凝胶，进行更安全，更快，更简单的凝胶电泳。此外，部分凝胶电泳系统采用了可在10分钟内运行的预制无缓冲液凝胶。它们还可结合分离核酸的数字成像和分析，以获得更有效和更简便的工作流程。