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因为免疫共沉淀Dynabeads磁珠可为小规模分离特殊蛋白（如免疫沉淀，IP）和蛋白复合物（免疫共沉淀，co-IP）带来结合能力/得率、重复性、纯度和成本的最佳平衡。Dynabeads不断证明其为全世界发展最快的免疫沉淀方法。
Dynabeads技术的优势：
- 低背景——几乎没有非特异性结合，无需预纯化即可获得高纯度蛋白质产量。
- 高可重复性——均一磁珠可确保最一致的结果。
- 高灵敏度——引用最多的方法是用于低丰度蛋白的敏感型应用，如ChIP和IP。
- 快速且简便—解决方案只需40分钟，且无需离心分离或预纯化步骤。
- 节省抗体——所有结合均发生于磁珠光滑的外表面，可节约珍贵抗体，并对每个样品提供一个经济有效的解决方案。
- 灵活——产品覆盖IP、Co-IP、pull-down和ChIP分析；是手动和自动化解决方案的理想选择。
- 可实现免疫沉淀自动化——了解现在的Thermo Scientific KingFisher平台 如何支持免疫沉淀自动化。
如何使用Dynabeads进行免疫共沉淀
第 1 步：抗体与磁珠结合
抗体与磁珠结合。Dynabeads磁珠预先包被Protein A、Protein G、抗鼠IgG或抗兔IgG抗体，基于快速动力学，加入的抗体仅需10分钟即可结合到磁珠上。生物素化抗体也可用于与链霉亲和素偶联的Dynabeads结合。在磁力架上对磁珠进行一次清洗，以去除未结合的抗体。
第 2 步：将样品加到磁珠中
将样品加到磁珠中。将含有蛋白质的样品掺入到结合抗体洗涤过的磁珠中，再孵育10分钟以结合目标靶蛋白。如果蛋白质是低丰度或低亲和力的，可延长孵育时间至1小时或过夜孵育；但是，孵育10分钟通常已足够。
第 3 步：清洗蛋白质结合的磁珠
清洗蛋白质结合的磁珠。为确保结合的目标蛋白保持高纯度，应使用缓冲液对结合在磁力架上的磁珠洗涤2-4次，以去除所有未结合的蛋白。高效的分离过程确保高信噪比。
第 4 步：洗脱蛋白质
洗脱蛋白质。如有需要，可使用温和的洗脱程序或变性洗脱程序将蛋白质从磁珠上洗脱（详见下文的洗脱说明）。
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该过程简单、快速，无需预澄清步骤，可实现高目标蛋白纯度、产量和一致的结果。
该过程简单、快速，无需预澄清步骤，可实现高目标蛋白纯度、产量和一致的结果。
使用Dynabeads进行不同程度的洗脱
免疫共沉淀磁珠上的重组Protein A和/或Protein G不含白蛋白结合位点，可避免污染蛋白的共纯化。抗体与磁珠在溶液中的结合，是一个平衡反应。为获得最多的抗体，应采用较低的反应体积，以维持磁珠和抗体的高浓度。由于无需对样品进行预处理（即使是粘稠样品），因此，无需稀释样品或磁珠。如果怀疑样品中的抗体浓度非常低，可增加磁珠的使用量。
作为从磁珠上将抗体洗脱下来一种方法，Dynabeads可在磷酸钠盐缓冲液中重悬。防止发生共洗脱，可在免疫沉淀前将抗体和 Protein A/G交联。这一步对于下游SDS-PAGE及放射自显影或免疫印迹分析是不必要的，对于银染或考马斯染料染色是可选的。
为您的实验寻找正确的免疫共沉淀产品
如果您具有可识别目标蛋白的抗体，请选择该产品
您对抗体结合产物的选择取决于下游检测。
抗体结合是最常用的方法，适用于目标抗体能与免疫磁珠直接结合或者能与磁珠表面的预包被配体间接结合的情况。
抗体结合产品选择指南
| Protein A、G、A/G | 二抗 （抗鼠、抗兔） | 表面活化磁珠（环氧树脂）* | |
|---|---|---|---|
| 产品 | 仅磁珠：试剂盒： | 仅磁珠： | 试剂盒： |
| 结合性质 | 非共价抗体结合 | 非共价抗体结合 | 共价抗体结合 |
| 抗体从磁珠上共洗脱 | 是+ | 是+ | 否 |
| 配体类型 | 不同的配体可与不同的种属和不同特异性的抗体亚类结合‡ | 抗鼠与鼠IgG1、IgG2a、IgG2b进行结合；抗兔与所有的兔IgG进行结合 | 所有抗体 |
| 质谱兼容性 | 兼容（Protein A/G） 尚未验证（Protein A、G） | 否 | 是 |
| 非特异性结合： | 低 | 低 | 超低 |
| 抗体结合时间和&温度（RT=室温） |
| >30 min，2–8°C | 16–24 hr，37°C |
*查看用于结合和捕获其他靶标的更多表面活化Dynabeads。
† 交联可避免抗体的共洗脱，但会降低目标蛋白的产量。
‡ 了解哪种抗体结合蛋白是您的免疫沉淀抗体的最佳选择。
如果您具有可识别目标蛋白的生物素抗体（或配体），请选择该产品。
使用生物素结合抗体和链霉亲和素包被磁珠进行免疫沉淀具有以下优势包括：
- 如果您的样品富含可溶性IgG
- 如果您的重组抗体缺少Fc区域
- 如果您的实验室已具备链霉亲和素包被的Dynabeads
- 如果您需要可兼容质谱分析的磁珠（二级包被和环氧树脂包被的Dynabeads也能兼容质谱分析）
为提高灵活性，我们可提供4种不同的链霉亲和素偶联的Dynabeads。 请在Dynabeads链霉亲和素选择指南 中查看不同特性。
在过去的25年中，链霉亲和素偶联的Dynabeads与生物素结合配体结合，已被广泛用于多种手动和自动化应用，并被成千上万篇文章 引用。链霉亲和素Dynabeads最广泛应用于核酸纯化以及二代测序 (NGS) 流程，但其亦用于免疫沉淀 (IP)。
如果您具有重组（融合标签）蛋白，请选择该产品
用于重组蛋白表达的热门融合标签包括：
- His标签——由6至9个组氨酸残基串联组成；主要用于固定化金属离子亲和层析 (IMAC) 纯化
- GST标签——由谷胱甘肽S转移酶 (GST) 组成，共211个氨基酸蛋白 (26 kDa)；主要用于谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化
- HA标签——由来自人流感血凝素——由来自人流感血凝素 (HA) 蛋白的多肽 (YPYDVPDYA) 组成；固定化抗HA抗体可用于对HA标记的重组蛋白进行免疫沉淀
- c-Myc标签——由来自人c-myc癌基因 (p62 c-myc) 的多肽 (EQKLISEEDL) 组成；固定化抗c-Myc抗体可用于对c-Myc标记的重组蛋白进行免疫沉淀。
- FLAG标签——由一种肽 (DYKDDDDK) 组成，其由固定的高亲和力大鼠单克隆抗体（克隆L5）进行识别；主要用于分离具有多个亚单位的蛋白质复合物，因为温和的纯化过程不会破坏这些相互作用
His和GST不是真正的表位标记，因为它们通常不是利用特异性抗体进行纯化或检测的。相反，HA和c-Myc标签是真正的表位标记，因为它们只能通过特异性抗体进行纯化或检测。表位标记几乎不被用于大量纯化，但经常被用于免疫沉淀或免疫共沉淀（IP，co-IP）。然而，这4种标签系统均可用于纯化或pull-down应用。
如果您已有可识别待捕获目标蛋白的生物素化抗体，您可使用以上任意一款产品制作您自己的亲和产品。
基准数据：对比Dynabeads与其他免疫共沉淀解决方案
Dynabeads在免疫沉淀 (IP) 方面不断超越其他方法和磁珠解决方案。依旧使用 Sepharose或琼脂糖珠浆。查看关于免疫沉淀的一些最常见的误区。
对比Dynabeads与树脂解决方案
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图 1.Dynabeads磁珠具有更短的操作时间和更高的产量。根据说明书，所有免疫沉淀方案采用等量的样品材料（相对于抗体含量）和细胞裂解物体积。在Dynabeads方法中，抗体表面的所有抗体均可有效结合，可实现理想的高重重复性抗原结合。
对比Dynabeads与磁性解决方案
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图 2.您选择的磁珠将影响结果。Dynabeads磁珠表面清晰，可完成必要的结合，没有捕获任何多余蛋白的内表面。(A) Dynabeads产品是均一性最好的单分散超顺磁珠，具有高度可控的产品质量和高度可重复性。(B–D) 其他供应商的磁珠形状和大小不一，可捕获杂质，具有较低的重复性和较多的非特异性结合。
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图 3.基准数据表明，Dynabeads磁性产品性能最佳，产量最高且非特异性结合最少。我们的磁珠还去除了不必要的操作步骤，将以最快的方案改善您的实验室生活。
使用KingFisher仪器自动进行免疫沉淀
在40分钟内完成蛋白质免疫沉淀，并使用KingFisher仪器上的Dynabeads获得稳定一致的结果。
Dynabeads技术的优势：
- 低背景——几乎没有非特异性结合，无需预纯化即可获得高纯度蛋白质产量。
- 高可重复性——均一磁珠可确保最一致的结果。
- 高灵敏度——引用最多的方法是用于低丰度蛋白的敏感型应用，如ChIP和IP。
- 快速且简便—解决方案只需40分钟，且无需离心分离或预纯化步骤。
- 节省抗体——所有结合均发生于磁珠光滑的外表面，可节约珍贵抗体，并对每个样品提供一个经济有效的解决方案。
- 灵活——产品覆盖IP、Co-IP、pull-down和ChIP分析；是手动和自动化解决方案的理想选择。
- 可实现免疫沉淀自动化——了解现在的Thermo Scientific KingFisher平台 如何支持免疫沉淀自动化。
如何使用Dynabeads进行免疫共沉淀
第 1 步：抗体与磁珠结合
抗体与磁珠结合。Dynabeads磁珠预先包被Protein A、Protein G、抗鼠IgG或抗兔IgG抗体，基于快速动力学，加入的抗体仅需10分钟即可结合到磁珠上。生物素化抗体也可用于与链霉亲和素偶联的Dynabeads结合。在磁力架上对磁珠进行一次清洗，以去除未结合的抗体。
第 2 步：将样品加到磁珠中
将样品加到磁珠中。将含有蛋白质的样品掺入到结合抗体洗涤过的磁珠中，再孵育10分钟以结合目标靶蛋白。如果蛋白质是低丰度或低亲和力的，可延长孵育时间至1小时或过夜孵育；但是，孵育10分钟通常已足够。
第 3 步：清洗蛋白质结合的磁珠
清洗蛋白质结合的磁珠。为确保结合的目标蛋白保持高纯度，应使用缓冲液对结合在磁力架上的磁珠洗涤2-4次，以去除所有未结合的蛋白。高效的分离过程确保高信噪比。
第 4 步：洗脱蛋白质
洗脱蛋白质。如有需要，可使用温和的洗脱程序或变性洗脱程序将蛋白质从磁珠上洗脱（详见下文的洗脱说明）。
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该过程简单、快速，无需预澄清步骤，可实现高目标蛋白纯度、产量和一致的结果。
该过程简单、快速，无需预澄清步骤，可实现高目标蛋白纯度、产量和一致的结果。
使用Dynabeads进行不同程度的洗脱
免疫共沉淀磁珠上的重组Protein A和/或Protein G不含白蛋白结合位点，可避免污染蛋白的共纯化。抗体与磁珠在溶液中的结合，是一个平衡反应。为获得最多的抗体，应采用较低的反应体积，以维持磁珠和抗体的高浓度。由于无需对样品进行预处理（即使是粘稠样品），因此，无需稀释样品或磁珠。如果怀疑样品中的抗体浓度非常低，可增加磁珠的使用量。
作为从磁珠上将抗体洗脱下来一种方法，Dynabeads可在磷酸钠盐缓冲液中重悬。防止发生共洗脱，可在免疫沉淀前将抗体和 Protein A/G交联。这一步对于下游SDS-PAGE及放射自显影或免疫印迹分析是不必要的，对于银染或考马斯染料染色是可选的。
为您的实验寻找正确的免疫共沉淀产品
如果您具有可识别目标蛋白的抗体，请选择该产品
您对抗体结合产物的选择取决于下游检测。
抗体结合是最常用的方法，适用于目标抗体能与免疫磁珠直接结合或者能与磁珠表面的预包被配体间接结合的情况。
抗体结合产品选择指南
| Protein A、G、A/G | 二抗 （抗鼠、抗兔） | 表面活化磁珠（环氧树脂）* | |
|---|---|---|---|
| 产品 | 仅磁珠：试剂盒： | 仅磁珠： | 试剂盒： |
| 结合性质 | 非共价抗体结合 | 非共价抗体结合 | 共价抗体结合 |
| 抗体从磁珠上共洗脱 | 是+ | 是+ | 否 |
| 配体类型 | 不同的配体可与不同的种属和不同特异性的抗体亚类结合‡ | 抗鼠与鼠IgG1、IgG2a、IgG2b进行结合；抗兔与所有的兔IgG进行结合 | 所有抗体 |
| 质谱兼容性 | 兼容（Protein A/G） 尚未验证（Protein A、G） | 否 | 是 |
| 非特异性结合： | 低 | 低 | 超低 |
| 抗体结合时间和&温度（RT=室温） |
| >30 min，2–8°C | 16–24 hr，37°C |
*查看用于结合和捕获其他靶标的更多表面活化Dynabeads。
† 交联可避免抗体的共洗脱，但会降低目标蛋白的产量。
‡ 了解哪种抗体结合蛋白是您的免疫沉淀抗体的最佳选择。
如果您具有可识别目标蛋白的生物素抗体（或配体），请选择该产品。
使用生物素结合抗体和链霉亲和素包被磁珠进行免疫沉淀具有以下优势包括：
- 如果您的样品富含可溶性IgG
- 如果您的重组抗体缺少Fc区域
- 如果您的实验室已具备链霉亲和素包被的Dynabeads
- 如果您需要可兼容质谱分析的磁珠（二级包被和环氧树脂包被的Dynabeads也能兼容质谱分析）
为提高灵活性，我们可提供4种不同的链霉亲和素偶联的Dynabeads。 请在Dynabeads链霉亲和素选择指南 中查看不同特性。
在过去的25年中，链霉亲和素偶联的Dynabeads与生物素结合配体结合，已被广泛用于多种手动和自动化应用，并被成千上万篇文章 引用。链霉亲和素Dynabeads最广泛应用于核酸纯化以及二代测序 (NGS) 流程，但其亦用于免疫沉淀 (IP)。
如果您具有重组（融合标签）蛋白，请选择该产品
用于重组蛋白表达的热门融合标签包括：
- His标签——由6至9个组氨酸残基串联组成；主要用于固定化金属离子亲和层析 (IMAC) 纯化
- GST标签——由谷胱甘肽S转移酶 (GST) 组成，共211个氨基酸蛋白 (26 kDa)；主要用于谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化
- HA标签——由来自人流感血凝素——由来自人流感血凝素 (HA) 蛋白的多肽 (YPYDVPDYA) 组成；固定化抗HA抗体可用于对HA标记的重组蛋白进行免疫沉淀
- c-Myc标签——由来自人c-myc癌基因 (p62 c-myc) 的多肽 (EQKLISEEDL) 组成；固定化抗c-Myc抗体可用于对c-Myc标记的重组蛋白进行免疫沉淀。
- FLAG标签——由一种肽 (DYKDDDDK) 组成，其由固定的高亲和力大鼠单克隆抗体（克隆L5）进行识别；主要用于分离具有多个亚单位的蛋白质复合物，因为温和的纯化过程不会破坏这些相互作用
His和GST不是真正的表位标记，因为它们通常不是利用特异性抗体进行纯化或检测的。相反，HA和c-Myc标签是真正的表位标记，因为它们只能通过特异性抗体进行纯化或检测。表位标记几乎不被用于大量纯化，但经常被用于免疫沉淀或免疫共沉淀（IP，co-IP）。然而，这4种标签系统均可用于纯化或pull-down应用。
如果您已有可识别待捕获目标蛋白的生物素化抗体，您可使用以上任意一款产品制作您自己的亲和产品。
基准数据：对比Dynabeads与其他免疫共沉淀解决方案
Dynabeads在免疫沉淀 (IP) 方面不断超越其他方法和磁珠解决方案。依旧使用 Sepharose或琼脂糖珠浆。查看关于免疫沉淀的一些最常见的误区。
对比Dynabeads与树脂解决方案
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图 1.Dynabeads磁珠具有更短的操作时间和更高的产量。根据说明书，所有免疫沉淀方案采用等量的样品材料（相对于抗体含量）和细胞裂解物体积。在Dynabeads方法中，抗体表面的所有抗体均可有效结合，可实现理想的高重重复性抗原结合。
对比Dynabeads与磁性解决方案
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图 2.您选择的磁珠将影响结果。Dynabeads磁珠表面清晰，可完成必要的结合，没有捕获任何多余蛋白的内表面。(A) Dynabeads产品是均一性最好的单分散超顺磁珠，具有高度可控的产品质量和高度可重复性。(B–D) 其他供应商的磁珠形状和大小不一，可捕获杂质，具有较低的重复性和较多的非特异性结合。
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图 3.基准数据表明，Dynabeads磁性产品性能最佳，产量最高且非特异性结合最少。我们的磁珠还去除了不必要的操作步骤，将以最快的方案改善您的实验室生活。
使用KingFisher仪器自动进行免疫沉淀
在40分钟内完成蛋白质免疫沉淀，并使用KingFisher仪器上的Dynabeads获得稳定一致的结果。
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出版物
免疫沉淀论文发表趋势
免疫沉淀的论文发表趋势说明了一切。Dynabeads 磁珠与免疫沉淀操作其他技术和产品的引用量正在急剧增长。
Dynabeads IP 引用文献。
Dynabeads ChIP 参考文献。
- Brinkmalm A, Öhrfelt A, Bhattacharjee P, Zetterberg H.Detection of α-Synuclein in Biological Samples Using Mass Spectrometry. Methods Mol Biol2019;1948:209-220。doi: 10.1007/978-1-4939-9124-2_16.
- Cicognola C, Brinkmalm G, Wahlgren J, Portelius E, Gobom J, Cullen NC, Hansson O, Parnetti L, Constantinescu R, Wildsmith K, Chen HH, Beach TG, Lashley T, Zetterberg H, Blennow K, Höglund K.Novel tau fragments in cerebrospinal fluid: relation to tangle pathology and cognitive decline in Alzheimer's disease.Acta Neuropathol.2019 Feb;137(2):279-296。doi: 10.1007/s00401-018-1948-2。Epub 2018 Dec 13.
- Gkanatsiou E, Portelius E, Toomey CE, Blennow K, Zetterberg H, Lashley T, Brinkmalm G. A distinct brain beta amyloid signature in cerebral amyloid angiopathy compared to Alzheimer's disease.Neurosci Lett.2019 May 14;701:125-131. doi: 10.1016/j.neulet.2019.02.033.Epub 2019 Feb 23.
- Kvartsberg H, Lashley T, Murray CE, Brinkmalm G, Cullen NC, Höglund K, Zetterberg H, Blennow K, Portelius E. The intact postsynaptic protein neurogranin is reduced in brain tissue from patients with familial and sporadic Alzheimer's disease.Acta Neuropathol.2019 Jan;137(1):89-102. doi: 10.1007/s00401-018-1910-3.Epub 2018 Sep 22.
- Öhrfelt A, Brinkmalm A, Dumurgier J, Brinkmalm G, Hansson O, Zetterberg H, Bouaziz-Amar E, Hugon J, Paquet C, Blennow K. The pre-synaptic vesicle protein synaptotagmin is a novel biomarker for Alzheimer's disease.Alzheimers Res Ther.2016年10月3日；8(1):41。
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