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膜蛋白表达和纯化 |
由于在与原生生态环境隔离的情况下，很难保持蛋白质的正确构象，因此难以生产 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 等膜蛋白。我们提供最佳的、可靠的膜蛋白表达和纯化工作流程解决方案，并由专家团队提供支持，从而以高效可靠的方式表达功能性膜蛋白。
- 最佳工作流程——通过快速、简单的方案实现原生蛋白质折叠，提高蛋白质产量
- 可扩展性——易于增加和 减少规模
- 通用性——提供多个系统 ，以满足膜蛋白研究需求
什么是膜蛋白？
膜蛋白（包括 GPCR 和离子通道）约占人体蛋白质的三分之一，对许多细胞过程至关重要，如离子传输、信号转导和化学反应催化。由于膜蛋白具有多种细胞功能，因此膜蛋白研究在药物发现过程中发挥着重要的作用。大约一半的药物通过与膜蛋白作用来达到治疗效果。
优化膜蛋白表达和膜蛋白纯化的 4 步法工作流程
众所周知，膜蛋白是一类难以表达、纯化和表征的蛋白质。 无论您是接触膜蛋白表达的新手还是想要优化方案的资深研究人员，都可以考虑使用该 4 步法工作流程，从而尽可能地提高膜蛋白表达和纯化实验的成功率。
基因合成与克隆——膜蛋白表达的第一步
为了尽可能地提高产量，目标基因或 DNA 起始物质通常经过密码子优化，以增强表达宿主的转录。
有几种方法可以获得用于表达试验的 DNA 起始物质： 可以使用 PCR 等标准分子生物技术，将目标基因分离放置在载体中，也可以将基因合成并克隆在相应载体中。
膜蛋白表达的基因合成与克隆技巧
- 创建最佳 DNA 序列——使用 GeneArt 密码子优化算法生成重组蛋白的最佳 DNA 序列。利用GeneOptimizer 算法，您不仅能使基因适应宿主系统的密码子用法，还能去除可能抑制表达的元素（例如，致死基序、剪接基因座和 RNA 二级结构）。总之，GeneOptimizer 算法考虑了 50 多个参数，以确定最优基因序列，从而在不改变蛋白序列的情况下获得更可靠、更高级别的蛋白表达。
- 大肠杆菌转化—为克隆应用和工作流程选择合适的感受态细胞，因为它们是实验成功的关键组成部分。在选择感受态大肠杆菌菌株时，存在很多需要考虑的方面。
- 质粒制备和纯化——使用PureLink Hi Pure 试剂盒等不含内毒素的质粒纯化试剂盒来纯化优质质粒 DNA。务必通过凝胶电泳和分光光度计 (A260/A280) 和 (A260/A230) 读数来确定 DNA 质量。在转染前确认最终产物的 DNA 序列。
推荐产品和服务
构建生产服务
在实验设计中选择合适的载体至关重要。在基因合成后，我们将提供多种载体递送方案，以尽量提高灵活性和递送速度。
构建生产试剂盒
Gibson Assembly 克隆是一种精细、稳健、无疤痕、无缝的克隆方法，可用于多个 DNA 片段的高效组装，无论其长度或末端兼容性如何。
载体
pcDNA3.4 和 pcDNA5/TO 是 EXPi293 系统中使用的载体，推荐用于优化这些系统中的膜蛋白表达。
Expi293 亲本的 pcDNA3.4 载体
Expi293 诱导平台的 pcDNA5/TO 载体 （四环素诱导蛋白表达）
感受态细胞
One Shot TOP10 化学感受态 大肠杆菌 具有先进的基因组 DNA 克隆功能，可最大限度地提高单管克隆效率。
质粒纯化
PureLink 快速低内毒素质粒纯化试剂盒的方案简单、快速，最多可提供 0.4 mg （中量）和 1.5 mg （大量）优质的低内毒素质粒 DNA，适用于健壮细胞系的标准转染以及 PCR、 体外 转录、 克隆、测序等应用。
自动化质粒纯化
KingFisher 系统技术提供了高效的工作流程解决方案，是最为通用的实验室的台式自动化系统之一，可用于 DNA、RNA、蛋白质和细胞的一致性提取和纯化。
网络讲座：膜蛋白：通过赛默飞的GeneArt 和 Salipro Biotech，了解从基因到冷冻电镜结构的知识
在本次网络讲座中，我们展示了如何将赛默飞和 Salipro Biotech 的专业知识相组合，用于形成膜蛋白药物靶标的基因到结构过程。GeneArt 平台以基因为起点，同时包括从基因到蛋白质的服务，该服务只需要一个蛋白质序列，涵盖从基因合成到蛋白质纯化的每一步，还涉及赛默飞专有的哺乳动物和昆虫表达系统：Expi293、ExpiCHO 或 ExpiSF9。
出色、可靠的膜蛋白表达
HEK-293 细胞和 CHO 细胞等哺乳动物细胞被广泛用作表达重组蛋白的宿主。特别是 HEK-293 细胞，该细胞是膜蛋白表达值得关注的系统，因为其具有适当折叠和/或靶蛋白最佳生物活性所需的翻译后修饰机制。
推荐产品和服务
Expi293 表达系统设计精巧，配有悬浮 293 细胞、优化的培养基和转染试剂，能够实现原生蛋白折叠和最大限度地提高蛋白产量，从而让您的研究实现应有的生物学意义。
体验 Expi293 结构生物学产品系列，这些产品经过严谨设计以实现均匀的糖基化和严格的控制表达，并首次在 HEK293 悬浮系统中进行蛋白标记。使用三种专用 Expi293F 细胞系（GnTI-、诱导表达和诱导表达 GnTI-）和 Met (-) 蛋白标记试剂盒实现快速、高产的蛋白质生产。
与我们合作，加快您的膜蛋白表达研究进程。我们将基因优化、合成 DNA 的专业知识和先进的 Expi293 表达系统相结合，从而获得更高的蛋白质产量，因此您可以安心地加快研究速度。
有关最佳蛋白表达的策略见以下两份海报
尽量提高膜蛋白表达水平的技巧
细胞培养
- 维持正确的培养液体积：摇瓶大小、适当的震荡速度、培养箱设置，以获得最佳效果。
- 在转染工作流程的第 1 天和转染的第 0 天为细胞提供新鲜的培养基。
- 注意，如果增强剂的添加量和预期不同，就会产生不理想的结果（ Expi293 海报图 11）。
- 考虑 Yeliseev （与赛默飞合作）如何在转染（Day 1）后的第二天将培养箱的温度从 37°C 降低到 32°C，以提高膜蛋白的表达水平。这一操作减缓了细胞的速度，使其侧重蛋白质表达而不是生长 [1]。
转染
- 等待 10~20 分钟以形成 DNA/Expifectamine 络合物。
- 参照 Expi293 用户指南 和 Expi293 线上学习，在 Expi293 中进行最佳转染实践。
- 查询 Expi293 结构生物学和诱导表达用户指南，在 Expi293 中进行最佳转染实践。
- 只使用优质的质粒 DNA；参见质粒纯化部分，确定最佳 DNA 浓度以获得最佳转染效率（ Expi293 海报图 10）。
收获
- 培养一段时间，根据产量和活性确定目标蛋白的合适收获时间。
选择合适的膜蛋白纯化策略来优化产量和活性
完成蛋白表达后，下一步是分离并纯化膜蛋白。选择合适的裂解试剂、纯化步骤、适当的纯化树脂，在该阶段尽量提高蛋白质的产量和活性。
通过适用于样本类型、蛋白分布、所需产量和下游应用的策略，收获膜蛋白。
用于蛋白增溶的去污剂
Thermo Scientific LMNG/CHS 溶液 (10:1) 是一种即用型配方，用于重要膜蛋白的增溶，同时保持结构完整性和活性。
Thermo Scientific 十二烷基麦芽糖新戊二醇 (LMNG) 是一种两亲性去污剂，最适合促进整合膜蛋白的增溶，同时保持结构完整性和活性。
Thermo Scientific DDM/CHS 溶液 (10:1) 是一种即用型溶液，用于膜蛋白的增溶，同时保持结构完整性和活性。
了解更多信息：用于蛋白增溶的去污剂
膜蛋白提取与分离
Thermo Scientific GPCR 提取试剂与稳定试剂可有效地从培养的哺乳类动物细胞或组织中提取和稳定 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 和其他膜相关蛋白，同时保持受体的长期完整性。
Thermo Scientific Pierce 细胞表面蛋白生物素化和分离试剂盒能实现质膜蛋白的选择性生物素化、增溶和富集。
Thermo Scientific Mem-PER Plus 膜蛋白提取试剂盒在提取和分离过程中的交叉污染率极低（通常低于 10%），膜蛋白组分中仅会掺入极少量细胞溶质蛋白。
了解更多信息：膜蛋白提取与分离
网络讲座：质膜蛋白的分离策略
本次网络讲座将重点关注提取、分离和富集细胞表面蛋白（包括稳定的功能性 G 蛋白偶联受体 (GPCR)）的优化技术。
纯化和净化
IMAC 纯化
这些与 EDTA 兼容的高容量 Ni-IMAC 磁珠和树脂用于纯化哺乳动物或昆虫细胞培养物中过度表达的 His 标签蛋白。纯化体系可兼容高达 20mM的 EDTA 和 20mM 的 DTT，而不影响性能。
亲和纯化
Thermo Scientific Pierce 抗DYKDDDDK 亲和树脂是一种对体外蛋白表达系统、细菌、酵母和哺乳动物细胞中表达的 DYKDDDDK 标签蛋白进行纯化和免疫沉淀 (IP) 的快速、便捷方法。
净化
透析、透滤和凝胶过滤（脱盐）是最广泛适用的蛋白质净化方法。这些方法基于公认的尺寸排阻原则，数十年来一直用于实验室研究。用于制造透析、透滤和脱盐设备的材料和设计的质量极佳，其规模、精细程度和便利性已经跟上了现代研究实验的变化速度。
定量分析、检测、表征纯化的膜蛋白，并评估其效价
蛋白表征（包括蛋白提取和纯化）是实验室工作流程的组成部分，包括蛋白提取和纯化。对细胞裂解物或纯化蛋白中的蛋白质进行鉴定和定量分析，以验证产量或归一化多个样品以进行并排比较。重组蛋白表达工作流程中常用的蛋白定量和表征方法包括：
- 蛋白定量检测
- 凝胶电泳
- 蛋白质印记
- ELISA
检测
Pierce Rapid Gold BCA 蛋白测定试剂盒是一种快速、双组分、高精度、兼容去污剂的检测法，经优化用于测定总蛋白质浓度。
冷冻电镜
Thermo Scientific VitroEase 缓冲液筛选试剂盒提供了预配制的缓冲液和去污剂以及全面的筛选策略，用于确定单颗粒冷冻电镜样本分析的最佳蛋白质条件。
非变性质谱分析
完整蛋白质分析解决方案最大限度地减少了蛋白质的复杂性，解决了鉴定问题。此外，还提供了多种蛋白质的超高分辨率。
Pierce 去污剂兼容型 Bradford 检测试剂盒改良自著名的 Bradford Coomassie 染料结合比色法，后者是一种快速的即用型总蛋白定量方法。
Thermo Scientific VitroEase 甲胺钨酸盐阴性染色剂是一种用于电子显微镜 (EM) 分析的简单、即用型阴性染色剂。
本页讨论了自上而下的质谱分析及其主要优点，包括检测降解产品和序列变异。
这些产品包括总蛋白检测试剂盒和试剂，用于在细胞裂解、标记或纯化后准确建立和测量总蛋白浓度。
Thermo Scientific VitroEase 甲胺钒酸盐阴性染色剂是一种用于电子显微镜 (EM) 分析的简单、即用型阴性染色剂。
了解更多信息： 综合结构生物学
基因合成与克隆——膜蛋白表达的第一步
为了尽可能地提高产量，目标基因或 DNA 起始物质通常经过密码子优化，以增强表达宿主的转录。
有几种方法可以获得用于表达试验的 DNA 起始物质： 可以使用 PCR 等标准分子生物技术，将目标基因分离放置在载体中，也可以将基因合成并克隆在相应载体中。
膜蛋白表达的基因合成与克隆技巧
- 创建最佳 DNA 序列——使用 GeneArt 密码子优化算法生成重组蛋白的最佳 DNA 序列。利用GeneOptimizer 算法，您不仅能使基因适应宿主系统的密码子用法，还能去除可能抑制表达的元素（例如，致死基序、剪接基因座和 RNA 二级结构）。总之，GeneOptimizer 算法考虑了 50 多个参数，以确定最优基因序列，从而在不改变蛋白序列的情况下获得更可靠、更高级别的蛋白表达。
- 大肠杆菌转化—为克隆应用和工作流程选择合适的感受态细胞，因为它们是实验成功的关键组成部分。在选择感受态大肠杆菌菌株时，存在很多需要考虑的方面。
- 质粒制备和纯化——使用PureLink Hi Pure 试剂盒等不含内毒素的质粒纯化试剂盒来纯化优质质粒 DNA。务必通过凝胶电泳和分光光度计 (A260/A280) 和 (A260/A230) 读数来确定 DNA 质量。在转染前确认最终产物的 DNA 序列。
推荐产品和服务
构建生产服务
在实验设计中选择合适的载体至关重要。在基因合成后，我们将提供多种载体递送方案，以尽量提高灵活性和递送速度。
构建生产试剂盒
Gibson Assembly 克隆是一种精细、稳健、无疤痕、无缝的克隆方法，可用于多个 DNA 片段的高效组装，无论其长度或末端兼容性如何。
载体
pcDNA3.4 和 pcDNA5/TO 是 EXPi293 系统中使用的载体，推荐用于优化这些系统中的膜蛋白表达。
Expi293 亲本的 pcDNA3.4 载体
Expi293 诱导平台的 pcDNA5/TO 载体 （四环素诱导蛋白表达）
感受态细胞
One Shot TOP10 化学感受态 大肠杆菌 具有先进的基因组 DNA 克隆功能，可最大限度地提高单管克隆效率。
质粒纯化
PureLink 快速低内毒素质粒纯化试剂盒的方案简单、快速，最多可提供 0.4 mg （中量）和 1.5 mg （大量）优质的低内毒素质粒 DNA，适用于健壮细胞系的标准转染以及 PCR、 体外 转录、 克隆、测序等应用。
自动化质粒纯化
KingFisher 系统技术提供了高效的工作流程解决方案，是最为通用的实验室的台式自动化系统之一，可用于 DNA、RNA、蛋白质和细胞的一致性提取和纯化。
网络讲座：膜蛋白：通过赛默飞的GeneArt 和 Salipro Biotech，了解从基因到冷冻电镜结构的知识
在本次网络讲座中，我们展示了如何将赛默飞和 Salipro Biotech 的专业知识相组合，用于形成膜蛋白药物靶标的基因到结构过程。GeneArt 平台以基因为起点，同时包括从基因到蛋白质的服务，该服务只需要一个蛋白质序列，涵盖从基因合成到蛋白质纯化的每一步，还涉及赛默飞专有的哺乳动物和昆虫表达系统：Expi293、ExpiCHO 或 ExpiSF9。
出色、可靠的膜蛋白表达
HEK-293 细胞和 CHO 细胞等哺乳动物细胞被广泛用作表达重组蛋白的宿主。特别是 HEK-293 细胞，该细胞是膜蛋白表达值得关注的系统，因为其具有适当折叠和/或靶蛋白最佳生物活性所需的翻译后修饰机制。
推荐产品和服务
Expi293 表达系统设计精巧，配有悬浮 293 细胞、优化的培养基和转染试剂，能够实现原生蛋白折叠和最大限度地提高蛋白产量，从而让您的研究实现应有的生物学意义。
体验 Expi293 结构生物学产品系列，这些产品经过严谨设计以实现均匀的糖基化和严格的控制表达，并首次在 HEK293 悬浮系统中进行蛋白标记。使用三种专用 Expi293F 细胞系（GnTI-、诱导表达和诱导表达 GnTI-）和 Met (-) 蛋白标记试剂盒实现快速、高产的蛋白质生产。
与我们合作，加快您的膜蛋白表达研究进程。我们将基因优化、合成 DNA 的专业知识和先进的 Expi293 表达系统相结合，从而获得更高的蛋白质产量，因此您可以安心地加快研究速度。
有关最佳蛋白表达的策略见以下两份海报
尽量提高膜蛋白表达水平的技巧
细胞培养
- 维持正确的培养液体积：摇瓶大小、适当的震荡速度、培养箱设置，以获得最佳效果。
- 在转染工作流程的第 1 天和转染的第 0 天为细胞提供新鲜的培养基。
- 注意，如果增强剂的添加量和预期不同，就会产生不理想的结果（ Expi293 海报图 11）。
- 考虑 Yeliseev （与赛默飞合作）如何在转染（Day 1）后的第二天将培养箱的温度从 37°C 降低到 32°C，以提高膜蛋白的表达水平。这一操作减缓了细胞的速度，使其侧重蛋白质表达而不是生长 [1]。
转染
- 等待 10~20 分钟以形成 DNA/Expifectamine 络合物。
- 参照 Expi293 用户指南 和 Expi293 线上学习，在 Expi293 中进行最佳转染实践。
- 查询 Expi293 结构生物学和诱导表达用户指南，在 Expi293 中进行最佳转染实践。
- 只使用优质的质粒 DNA；参见质粒纯化部分，确定最佳 DNA 浓度以获得最佳转染效率（ Expi293 海报图 10）。
收获
- 培养一段时间，根据产量和活性确定目标蛋白的合适收获时间。
选择合适的膜蛋白纯化策略来优化产量和活性
完成蛋白表达后，下一步是分离并纯化膜蛋白。选择合适的裂解试剂、纯化步骤、适当的纯化树脂，在该阶段尽量提高蛋白质的产量和活性。
通过适用于样本类型、蛋白分布、所需产量和下游应用的策略，收获膜蛋白。
用于蛋白增溶的去污剂
Thermo Scientific LMNG/CHS 溶液 (10:1) 是一种即用型配方，用于重要膜蛋白的增溶，同时保持结构完整性和活性。
Thermo Scientific 十二烷基麦芽糖新戊二醇 (LMNG) 是一种两亲性去污剂，最适合促进整合膜蛋白的增溶，同时保持结构完整性和活性。
Thermo Scientific DDM/CHS 溶液 (10:1) 是一种即用型溶液，用于膜蛋白的增溶，同时保持结构完整性和活性。
了解更多信息：用于蛋白增溶的去污剂
膜蛋白提取与分离
Thermo Scientific GPCR 提取试剂与稳定试剂可有效地从培养的哺乳类动物细胞或组织中提取和稳定 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 和其他膜相关蛋白，同时保持受体的长期完整性。
Thermo Scientific Pierce 细胞表面蛋白生物素化和分离试剂盒能实现质膜蛋白的选择性生物素化、增溶和富集。
Thermo Scientific Mem-PER Plus 膜蛋白提取试剂盒在提取和分离过程中的交叉污染率极低（通常低于 10%），膜蛋白组分中仅会掺入极少量细胞溶质蛋白。
了解更多信息：膜蛋白提取与分离
网络讲座：质膜蛋白的分离策略
本次网络讲座将重点关注提取、分离和富集细胞表面蛋白（包括稳定的功能性 G 蛋白偶联受体 (GPCR)）的优化技术。
纯化和净化
IMAC 纯化
这些与 EDTA 兼容的高容量 Ni-IMAC 磁珠和树脂用于纯化哺乳动物或昆虫细胞培养物中过度表达的 His 标签蛋白。纯化体系可兼容高达 20mM的 EDTA 和 20mM 的 DTT，而不影响性能。
亲和纯化
Thermo Scientific Pierce 抗DYKDDDDK 亲和树脂是一种对体外蛋白表达系统、细菌、酵母和哺乳动物细胞中表达的 DYKDDDDK 标签蛋白进行纯化和免疫沉淀 (IP) 的快速、便捷方法。
净化
透析、透滤和凝胶过滤（脱盐）是最广泛适用的蛋白质净化方法。这些方法基于公认的尺寸排阻原则，数十年来一直用于实验室研究。用于制造透析、透滤和脱盐设备的材料和设计的质量极佳，其规模、精细程度和便利性已经跟上了现代研究实验的变化速度。
定量分析、检测、表征纯化的膜蛋白，并评估其效价
蛋白表征（包括蛋白提取和纯化）是实验室工作流程的组成部分，包括蛋白提取和纯化。对细胞裂解物或纯化蛋白中的蛋白质进行鉴定和定量分析，以验证产量或归一化多个样品以进行并排比较。重组蛋白表达工作流程中常用的蛋白定量和表征方法包括：
- 蛋白定量检测
- 凝胶电泳
- 蛋白质印记
- ELISA
检测
Pierce Rapid Gold BCA 蛋白测定试剂盒是一种快速、双组分、高精度、兼容去污剂的检测法，经优化用于测定总蛋白质浓度。
冷冻电镜
Thermo Scientific VitroEase 缓冲液筛选试剂盒提供了预配制的缓冲液和去污剂以及全面的筛选策略，用于确定单颗粒冷冻电镜样本分析的最佳蛋白质条件。
非变性质谱分析
完整蛋白质分析解决方案最大限度地减少了蛋白质的复杂性，解决了鉴定问题。此外，还提供了多种蛋白质的超高分辨率。
Pierce 去污剂兼容型 Bradford 检测试剂盒改良自著名的 Bradford Coomassie 染料结合比色法，后者是一种快速的即用型总蛋白定量方法。
Thermo Scientific VitroEase 甲胺钨酸盐阴性染色剂是一种用于电子显微镜 (EM) 分析的简单、即用型阴性染色剂。
本页讨论了自上而下的质谱分析及其主要优点，包括检测降解产品和序列变异。
这些产品包括总蛋白检测试剂盒和试剂，用于在细胞裂解、标记或纯化后准确建立和测量总蛋白浓度。
Thermo Scientific VitroEase 甲胺钒酸盐阴性染色剂是一种用于电子显微镜 (EM) 分析的简单、即用型阴性染色剂。
了解更多信息： 综合结构生物学
参考文献
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仅供科研使用，不可用于诊断目的。