适用于 HT 检测的 HepG2 细胞系球状体的生成和表征

从液氮中解冻后，将细胞维持培养在 Nunclon Delta T25 细胞培养瓶内添加了 10% Gibco FBS 和 1% Pen-Strep 的 Gibco MEM 培养基中，经2次传代后接种用于生成球状体。然后遵循 ATCC 实验方案进行传代培养。

• Nunclon Sphera 96孔板
• 完全培养基（添加了 10% FBS 和 1% Pen-Strep 的 Gibco MEM 培养基）
• TrypLE 试剂
• 配有旋转吊篮转头和96孔板支架的离心机
• Countess II 细胞计数仪或血细胞计数器
• 15/50 ml 离心管
• 多通道移液器
• 无菌试剂加样槽

1. 培养瓶融合度达到 60%–70% 后，从培养瓶中吸出培养基，在 1X PBS 中洗涤细胞一次，然后用 1–1.5 ml TrypLE 试剂解离。
2. 使用4倍体积的完全培养基中和 TrypLE 试剂，并使用 Countess II 细胞计数舱室采集活细胞计数和活力。采集活力达到 >90% 的细胞用于生成球状体。
3. 在完全培养基中对细胞储备液进行 1:10 至 1:20 稀释，以更容易计算细胞接种密度。
4. 使用细胞接种计算器计算接种细胞数。 

5. 使用多通道移液器将所需数量的细胞接种到 Nunclon Sphera 微孔板各自的孔中。最终体积保持在 200 μl。
6. 将微孔板以 1,500 rpm 的转速离心10分钟，然后置于 37°C 和 5% CO₂ 条件下的培养箱中。

7. 每隔一天按 1:1 的比例更换培养基。（吸出 100 μl 用后培养基，加入 100 μl 新鲜培养基）。培养基更换后，以 1,200 rpm 的转速对微孔板离心5分钟，然后放回上述条件下的培养箱中。

8. 球状体准备就绪，具体取决于接种数量。

接种 312–20,000 个 HepG2 细胞用于生成球状体，并在第2天、第4天、第6天和第8天使用EVOS XL 显微镜在4倍放大倍率下捕获球状体的明场图像。比例尺 = 1,000 µm。

1. 第6天，使用 PrestoBlue HS 细胞活力检测试剂进行细胞活力检测。
2. 将 PrestoBlue HS 试剂加热至室温。然后，使用多通道移液器将 20 μl 试剂添加到含有 200 μl 培养基的每个孔中，并通过 2–3 次移液轻轻混合。使用仅含新鲜培养基和试剂的孔作为归一化对照（空白）。
3. 将微孔板在 37°C 下孵育4小时。
4. 之后，使用具有以下设置的 Varioskan LUX 多功能酶标仪读取荧光值：

• 激发波长：560 nm；发射波长：590 nm
• 12 nm 激发带宽
• 测量时间：100 ms
• 底部光学读数
• 仪器温度：37°C

将数据导出至 Microsoft Excel 进行分析。按空白对照值对各荧光值进行归一化，并使用绘图和统计软件绘制每个细胞接种数至少6份重复样本的平均值。该实验重复3次。

1. 使用 LIVE/DEAD 活力/细胞毒性检测试剂盒进行染色，以显现第6天 HepG2 球状体的活细胞和死细胞群。
2. 在新鲜培养基中加入最终浓度分别为 1 μM  和  3 μM 的钙黄绿素 AM 和 EthD-1，制得工作溶液（参见应用文档了解关于球状体荧光染色的更多信息）。
3. 向工作溶液中添加 NucBlue Live ReadyProbes 试剂（2滴/ml），用于球状体核染色。将用后的球状体培养基以 1:1 的比例更换为工作溶液，然后在 37°C 下孵育3小时。
4. 之后，使用 PBS + 5% FBS（1:1 更换）洗涤三次，最后重悬于 PBS + 0.5% FBS 中（1:1 更换），每次在室温下以 500 rpm 的转速离心微孔板5分钟，以沉淀球状体，并在荧光成像过程中尽量减弱背景。
5. 然后使用 CellInsight CX7 高内涵筛选平台在 4X 物镜下进行球状体成像。

备注：随着球状体直径增大，染料渗透率下降，并且死细胞群扩大（红色染色）。

显示活细胞（绿色染色）和死细胞（红色染色）群的第6天 HepG2 球状体的代表性图像（上方一行图像）。下方一行图像显示核染色。比例尺 = 100 µm。