适用于 HT 检测的 PANC-1 细胞系球状体的生成

球状体生成前 PANC-1 细胞的维持培养

从液氮中解冻后，将 PANC-1 细胞维持培养在 Nunclon Delta T25 细胞培养瓶内添加了 10% Gibco FBS 和 1% Pen-Strep 的 Gibco DMEM 培养基中，经2次传代后接种用于生成球状体。然后遵循 ATCC 实验方案进行传代培养。

所需材料

• Nunclon Sphera 96孔板
• 完全培养基（添加了 10% FBS 和 1% Pen-Strep 的 Gibco DMEM 培养基）
• TrypLE 试剂
• 配有旋转吊篮转头和96孔板支架的离心机
• Countess II 自动细胞计数仪或血细胞计数器
• 15/50 ml 离心管
• 多通道移液器

实验方案

1. 在球状体生成当天，将包含细胞的培养瓶放入生物安全柜中。
2. 丢弃培养瓶中的用后培养基，用 1x PBS 洗涤细胞，并使用 1-2 ml TrypLE 试剂解离细胞。使细胞完全脱离表面。
3. 添加4倍体积的新鲜完全培养基，以中和 TrypLE 试剂。
4. 对细胞进行离心，向沉淀物中加入新鲜完全培养基。
5. 使用 Countess II 自动细胞计数仪或血细胞计数器进行细胞计数。
6. 我们建议您使用细胞活力 ≥90% 的细胞来生成球状体。
7. 可从细胞接种密度不同的孔中生成球状体。我们建议您使用细胞接种计算器（如下）计算每种接种密度所需的细胞数量，然后将该数量的细胞从主储备液转移到微孔板上。
8. 将 200 µl 包含所需细胞数量的细胞悬液接种于96孔 Nunclon Sphera 微孔板的每个孔中，并对孔进行标记。
9. 在室温下，使用推荐的微孔板支架在旋转吊篮转头中以 1,500 rpm 的转速对96孔板离心10分钟，然后在 37°C 和 5% CO₂ 的条件下孵育微孔板。
10. 将当天记录为第0天。

球状体维持培养

• Nunclon Sphera 微孔板上的 PANC-1 细胞状态稳定，不需要 ECM 即可生长。
• 在无需更换任何培养基的情况下可维持培养球状体至第7天。至少每24小时观察一次球状体培养板，以监测形态变化。
• 为获得良好的球状体用于高通量检测，我们建议您从第5天至第7天收获球状体。
• 最适合高通量检测的球状体直径通常为 300-500 μm。根据接种密度，此直径可能有所不同（请参见下图）。

提示

• 离心是将细胞聚集在一起形成球状体的重要步骤，因此我们强烈建议您在接种后对微孔板进行离心。
• 离心后，避免摇动微孔板或者施加任何机械应力，因为这样会扰动球状体。
• 建议采用每孔 625–1,250 个细胞的接种密度，以获得直径为 300–500 μm 的球状体。
• 第7天之后，如果希望延长球状体生长时间，请务必补充培养基。将 50% 用后培养基更换为 50% 新鲜完全培养基，以便进一步观察。
• 执行移液和等分时应特别小心，不要扰动球状体。移液和吸液时，将移液器吸头置于孔的侧壁，有助于尽量减少对球状体的干扰。

不同密度（312–10,000 个细胞）条件下在 Nunclon Sphera 微孔板中生成的 PANC-1 球状体。使用 EVOS M7000 显微镜在第3天、第5天和第7天捕获图像。比例尺为 650 µm。

尺寸和球度评估

球状体尺寸通常取决于起始细胞接种密度，因此，在进行高通量实验之前，请务必先对将要使用的细胞系进行此方面的评估。下面的图表显示了在一系列的 PANC-1 细胞接种密度下所获得的不同球状体尺寸。我们建议在高通量实验中使用直径范围为 300–500 μm 的球状体。

不同细胞密度条件下生成的 PANC-1 球状体可在 Nunclon Sphera 微孔板中生长达7天。使用 ImageJ 测量和分析不同天数内的球状体直径。

球度是一种表示球状体圆度或圆形性质的测量参数。细胞越接近球形，在实验过程中就越可能保持完整，所以首选高度球形的球状体。下面的条形图显示了从一系列接种密度条件下生成的球状体中获得的球度。

不同接种密度下 PANC-1 球状体的球度，以百分比表示。100% 球度表示完美圆形的球状体。误差线代表 SEM。