AlgiMatrix™ 3D 培养系统

描述

AlgiMatrix™ 3D 培养系统是一种非动物源性生物支架，可促进三维 (3D) 细胞培养。每个生物支架都是一个孔径为 ~50–200 μm 的海藻酸盐海绵。在这种海绵中生长的细胞更接近正常细胞形态和行为，为许多研究领域的 3D 细胞培养模型提供了出色的解决方案，如毒理学、药物开发、癌症研究和组织工程。 

提供的 AlgiMatrix™ 生物支架以冻干形式储存于无菌板孔中，在室温下保持稳定。AlgiMatrix™ 3D 培养系统适用于许多基于细胞的筛选和药物发现程序，包括多细胞肿瘤球状体测定 (MCTS)、肝细胞和心肌细胞器官形成研究、共培养研究、高通量药物筛选和胚胎干细胞 3D 分化研究。

预期用途

仅供研究使用。不得用于任何动物或人类的治疗或诊断。

构建 AlgiMatrix™ 3D 细胞培养实验

• 计划同时使用每个板的所有孔。如果将空孔留在加湿培养箱中而不接种，它们会
  吸收水分并发生变形，从而限制细胞的吸附。
• 选用立式或倒置实验室显微镜查看球状体。立式显微镜可能具有更好的可视化效果，但是，
  根据透镜的焦距，可能需要移除板盖，使其局限于培养后的观察。
• 在层流罩中以无菌方式执行所有程序。
• 优化培养物接种和孵育条件可能会提高性能。

 
AlgiMatrix™ 使用提示

• 通常情况下，细胞培养基的更换频率至少应与 2D 培养相同。在较低的细胞密度下，可降低
  培养基更换频率。培养基更换间隔勿超过5天。要求因细胞类型和应用而异。
• 要观察 AlgiMatrix™ 海绵内部或顶部的细胞，请减小培养基体积或将海绵重新安置到干燥的孔中。可以倒置海绵，以便更好地观察海绵顶部的细胞。
• 避免同时使用磷酸盐缓冲盐水溶液与 AlgiMatrix™。PBS 会软化海绵并导致培养基浑浊。

6孔板附带 AlgiMatrix™ 紧固缓冲液，而对于24孔和96孔板，可单独购买此缓冲液。它是一种等渗中性 pH 缓冲溶液，专为增强生物支架的硬度而设计。硬度较高的海绵较不容易受到细胞和环境力量引起的微孔扩张和收缩，还容易使用无菌镊子进行夹取和操作。这样可以将海绵转移到不同的孔中，或将海绵倒置以接种或观察海绵两侧的细胞。对于硬度较高的海绵，在将细胞添加到海绵之前向细胞和培养基中添加紧固缓冲液。或者，对于可能对游离钙离子敏感的细胞培养应用，您可以先使用紧固缓冲液重新水化海绵，然后再添加细胞和培养基。

使用 AlgiMatrix™ 溶解缓冲液（单独销售）可快速且轻松地从 AlgiMatrix™ 生物支架中回收细胞。AlgiMatrix™ 溶解缓冲液旨在快速完全溶解海绵而不会破坏细胞球状体、团簇或其他 3D 结构。它可安全用于所有细胞类型，可用于溶解 AlgiMatrix™ 板孔中的单个海绵或者离心管或其他容器中的多个海绵。

6孔 AlgiMatrix™ 微孔板需要使用 AlgiMatrix™ 紧固缓冲液；24孔和96孔板可以选择使用此缓冲液，不过我们强烈建议使用此缓冲液。以下是使用紧固缓冲液培养细胞的常规实验方案。可针对特定细胞类型优化体积。提供的所有数量均以每孔计。

建议的紧固缓冲液浓度

用于一般用途时，我们建议溶液中的紧固缓冲液浓度为 10% (v/v)。用于硬度较高的 AlgiMatrix™ 海绵时，浓度可提高至 50% (v/v)。较低的紧固缓冲液浓度会导致海绵变软并具有更好光学清晰度。浓度低于 5% (v/v) 可能会导致海绵过软且在移除培养基过程中容易受损。

备注：对于可能对游离钙离子敏感的细胞培养应用，您可以先使用紧固缓冲液重新水化海绵，然后再添加细胞和培养基；请参见本页面底部的实验方案。

1. 将细胞重悬于标准细胞培养基中，然后向此悬液中加入 10% (v/v) AlgiMatrix™ 紧固缓冲液中（即1份紧固缓冲液对应9份含细胞的培养基）。最佳的最终细胞浓度因细胞类型而异，但通常 1 × 10⁶ 个细胞/mL 是可靠的目标浓度。虽然 10% (v/v) 紧固缓冲液可实现海绵透明度与硬度之间的最佳平衡，但某些应用可能在优化此浓度后才会获益。
2. 从包装中取出 AlgiMatrix™ 3D 培养系统微孔板并丢弃干燥剂。
3. 根据您的孔板类型，用移液器将以下体积的步骤1悬液接种到每个干燥海绵的顶部：
   
   6孔板           24孔板          96孔板
   2 mL                        400–500 μL             80–120 μL
4. 可选： 立即以 100 × g 的设置将孔板离心4分钟，以动态接种海绵。通过动态接种，某些细胞类型可以更彻底地包埋在海绵中。
   备注：海绵将变湿润和半透明。基质中可能会出现气泡；它们会随时间变化而减少或消失。如果海绵内部或下方出现大气泡，请使用移液器吸头朝孔板底部轻轻推动海绵来释放气泡。
5. 重新水化后约5分钟，海绵应呈现为泡沫状，表面干燥或潮湿。根据您的孔板和细胞类型，将以下额外体积的培养基（不含紧固缓冲液）添加到每个海绵顶部（拟将该体积作为一般起始体积；体积可能因细胞类型而异）：
   
   6孔板          24孔板          96孔板
   2–3 mL                  400–500 μL               80–120 μL
6. 在培养箱中孵育孔板（在含 4%–6% CO₂ 的 36–38°C 潮湿空气环境中）。请勿堆叠多块微孔板。
7. 根据细胞增殖情况或当培养基开始变色时更换培养基。要观察 AlgiMatrix™ 海绵内部或顶部的细胞，请减小培养基体积或将海绵迁移到干燥的孔中。可以倒置海绵，以便更好地观察海绵顶部的细胞。
    

   
   
   
   
   备注：移除用后培养基时，切勿让抽吸式移液器吸头接触海绵。将吸头与孔壁保持一定角度，并用另一个移液器吸头挡住该吸头，以避免吸入海绵（参见图片）。如果海绵卡在抽吸器中，请立即停止吸入并释放海绵，然后轻轻再次尝试。如果海绵被部分吸入，请勿使用该孔进行定量测定。有关培养基更换的其他建议，请参阅页面顶部的提示。

8. 几天后，从培养箱中取出孔板并在光学显微镜（低倍）下检查是否形成球状体。

需要较低钙水平的细胞培养应用的替代紧固缓冲液实验方案

AlgiMatrix™ 紧固缓冲液含有高钙水平。如果特定细胞培养应用需要更低钙水平的环境，请修改培养方案的前几个步骤，如下所述：

1. 向 AlgiMatrix™ 海绵添加含 10% (v/v) 紧固缓冲液但不含细胞的细胞培养基。
2. 重新水化约5分钟。
3. 可选：如果您在细胞接种培养基中使用高浓度紧固缓冲液（例如 50% v/v），则使用不含紧固缓冲液的培养基冲洗海绵一次。
4. 将细胞接种在标准培养基（不含紧固缓冲液），然后继续孵育。

尽管建议所有孔板类型使用 Algimatrix™ 紧固缓冲液，但如下文所述，在24孔和96孔板中可以不使用紧固缓冲液进行细胞培养。如下文所示，以低密度或高密度进行接种，或针对特定细胞类型进行优化。一般情况下，低密度接种的细胞可以培养5天而不需更换培养基，而高密度接种的细胞需要每日更换培养基。提供的所有数量均以每孔计。

1. 从包装中取出 AlgiMatrix™ 3D 培养系统24孔或96孔板。丢弃干燥剂。
2. 从培养物中取出细胞，重悬于培养基中，并使用悬液接种每个海绵，如下所示：
   
   

   培养类型	96孔板	24孔板
   低密度培养	25,000个细胞/孔：以 8.33 × 105 个细胞/mL 的浓度重悬。使用具有8通道的电动多通道移液器移取 30 μL 接种到每个干燥海绵的中间位置。	125,000个细胞/孔：以 0.417 × 106 个细胞/mL 的浓度重悬。使用移液器移取 300 μL 接种到每个干燥海绵的中间位置。
   高密度培养	300,000个细胞/孔：以 1 × 107 个细胞/mL 的浓度重悬。使用具有8通道的电动多通道移液器移取 30 μL 接种到每个干燥海绵的中间位置。	150万个细胞/孔：以 5.0 × 106 个细胞/mL 的浓度重悬。使用移液器移取 300 μL 接种到每个干燥海绵的中间位置。

    
3. 可选：立即以 100 × g 的设置将孔板离心4分钟，以动态接种海绵。通过动态接种，某些细胞类型可以更彻底地包埋在海绵中。
4. 将孔板放入培养箱中（在含 4%–6% CO₂ 的 36–38°C 潮湿空气环境中）孵育10分钟。请勿堆叠多块微孔板。
5. 从培养箱中取出孔板并放入层流罩中。室温下向每孔加入以下体积的细胞培养基：
   
   24孔板  96孔板
   1000 μL                 200 μL
   
   备注： 接种后支架中将立即出现大量气泡。这是正常现象；由于细胞消耗氧气，接种的孔中的气泡将在 2-3 天后消失。
6. 在培养箱中孵育孔板（在含 4%–6% CO₂ 的 36–38°C 潮湿空气环境中）。为了避免外侧孔出现水蒸发等边缘效应（某些培养箱存在此问题），请将孔板放在穿孔铝箔覆盖的容器内的湿润纸巾上。
7. 一般而言，在不更换培养基的情况下，低密度培养物可维持5天。对于高密度培养物，应每日补充培养基，轻轻取回以下体积的用后培养基，并更换为等量的新鲜培养基：
   
   24孔板 96孔板
   250–750 μL 50–150 μL
   
   备注：对于以较低密度接种的培养物，当培养基变黄时可能需要进行更换。
   
   备注：移除用后培养基时，切勿让移液器吸头接触生物支架。将吸头与孔壁保持一定角度，以避免吸入海绵（参见图片）。如果松散的生物支架妨碍重新更换培养基，则向每孔中添加培养基（96孔板添加 ~100 μL，24孔板添加 ~500 μL）。以 400 × g 的设置对孔板离心7分钟，然后取出培养基并加入新鲜培养基，如有需要可重复一次。
8. 几天后，从培养箱中取出孔板并在光学显微镜（低倍）下检查是否形成球状体。
   
   
   
   

溶解海绵所需的 AlgiMatrix™ 溶解缓冲液用量取决于 AlgiMatrix™ 板孔的规格以及在海绵上使用的 AlgiMatrix™ 紧固缓冲液（如有）的浓度。使用下表可确定每个 AlgiMatrix™ 板孔所需使用的溶解缓冲液体积。

1. 使用移液器从包含海绵的容器中吸出所有残留的液体培养基，仅留下湿海绵。
   
   
2. 可使用上表确定每孔需添加的溶解缓冲液体积。取相应体积直接添加到海绵上。备注：或者，您也可以将一个或多个 AlgiMatrix™ 海绵转移到单独的容器（例如离心管）中进行溶解。在这种情况下，请使用足量的溶解缓冲液以完全浸没海绵。如果需要，可向悬液中添加细胞培养基（0.25 mL/mL 溶解缓冲液）。
   
   
3. 孵育 ~5 分钟，同时在显微镜下检查海绵。通常，海绵将在添加溶解缓冲液后5分钟内开始明显降解。如果在5分钟内未观察到细胞释放，则将另一体积的溶解缓冲液直接加到海绵（按上表所示）上，并另外孵育5分钟。10分钟后，海绵应完全降解。备注：我们建议将细胞留在溶解缓冲液中的时间不得超过30分钟。
   
   
4. 轻轻吸出孔内容物，将其转移至无菌离心管或多支试管中。向离心管中添加培养基。
   
   
5. 以 200 × g 的设置离心5分钟以沉淀释放的细胞，然后移除上清液，并根据需要重悬沉淀物。
   
   
6. 可选：为移除随回收细胞一起存留的任何碎片，将同等体积的溶解缓冲液添加到细胞悬液中，并轻轻搅拌最长2分钟。重复上述离心程序。
   

从球状体中分离单个细胞

1. 如需分离单个细胞，请先使用溶解缓冲液分离球状体，如上所述。
   
   
2. 在含有球状体的离心管中加入 5 mL TrypLE™ Select 或胰蛋白酶-EDTA，置于 37°C 下，并研磨 5–10 分钟，直至球状体解离。
   
   
3. 球状体解离后，加入 5 mL 生长培养基，以 400 × g 的设置离心7分钟，并移除上清液。然后继续进行测定。