球状体生成前的细胞系维持培养

从液氮中解冻后,将 SW480 细胞维持培养在 Nunclon Delta T25 细胞培养瓶内添加了 10% Gibco FBS 和 1% Pen-Strep 的 Gibco DMEM 培养基中,经2次传代后接种用于生成球状体。然后遵循 ATCC 实验方案进行传代培养。

所需材料:

使用 I 型胶原蛋白(作为细胞外基质或 ECM)制备培养基:

  • 根据细胞系的性质,可以在有或没有细胞外基质支持的条件下生成球状体。SW480 细胞需要粘附 ECM 才能在有限的 3D 空间内生长。此外,重要的是确定用于生成球状体的 I 型胶原蛋白或 ECM 的浓度。
  • 一些细胞系在所有不同的细胞密度下可能只需一种浓度的 ECM,而 SW480 细胞所需的 ECM 取决于细胞数。在此,我们确定了生成不同尺寸的球状体所需的 I 型胶原蛋白用量。请使用下表作为参考,了解各细胞密度下所需的 I 型胶原蛋白用量。
要接种的
细胞数量
I 型胶原蛋白用量
每毫升 (ml) 培养基
10,000个细胞30 µg
5,000个细胞15 µg
2,500个细胞8 µg
1,250个细胞4 µg
625个细胞2 µg
312个细胞1 µg
  • 根据您的细胞密度制备包含 I 型胶原蛋白的培养基,然后再继续实验方案。将培养基混合物储存于 4°C 下,在细胞接种前使用。始终建议每次制备新鲜的培养基混合物。

方案:

  1. 在球状体生成当天,将指定培养瓶放入生物安全柜中。
  2. 丢弃培养瓶中的用后培养基,用 1x PBS 洗涤细胞,并使用 1-2 ml TrypLE 试剂解离细胞。使细胞完全脱离表面。
  3. 添加4倍体积的新鲜完全培养基,以中和 TrypLE 试剂。
  4. 对细胞进行离心,向沉淀物中加入新鲜的完全培养基。
  5. 使用 Countess II 细胞计数仪或血细胞计数器进行细胞计数。
  6. 确保细胞存活率超过 >90%。 建议在保持良好细胞活力的条件下继续操作。

球状体的生成:

  1. 不同的细胞密度可产生不同尺寸的球状体;因此可计算所需的细胞数并从主储备液中等分相应数量。使用接种计算器(如下)计算所需的细胞数。
  2. 确保根据细胞密度将细胞等分到含 I 型胶原蛋白的培养基中。请参阅上表,了解适用于不同密度的 I 型胶原蛋白用量。
  3. 将 200 µl 包含所需细胞数量的细胞悬液接种于96孔 Nunclon Sphera 微孔板的每个孔中,并进行标记。
  4. 在室温下,使用推荐的微孔板支架在旋转吊篮转头中以 1,500 rpm 的转速对96孔板离心10分钟,然后在 37°C 和 5% CO2 的条件下孵育微孔板。
  5. 将当天记录为第0天。

球状体维持:

  • 在无需更换任何培养基的情况下可维持培养球状体至第7天。至少每24小时观察一次球状体培养板,以监测形态变化。
  • SW480 细胞从第3天开始生成球状体。 因此,建议从第3天至第7天收集球状体用于高通量检测。
  • 最适合高通量检测的球状体直径应为 300–500 μm。这可能因接种密度而异。有关更多信息,请参阅下面的结果。

提示:

  • 离心是将细胞聚集在一起形成球状体的重要步骤。因此,强烈建议接种后对培养板进行离心。
  • 离心后,避免摇动培养板或者施加任何机械应力。否则会扰动球状体。
  • 建议采用每孔 625–2,500 个细胞的接种密度,以获得直径为 300–500 μm 的球状体。
  • 第7天之后,如果要延长球状体生长时间,则必须更换培养基。将 50% 的用后培养基更换为 50% 的新鲜完全培养基,以便进一步观察。
  • 移液和等分应小心进行,不要扰动球状体。将吸头置于在孔的侧壁,可避免此问题。
  • 对大量球状体进行铺板时,可以使用多通道移液器进行接种。

SW480 球状体形态

Morphology of SW480 spheroids generated in various densities from 625 to 10,000 cells.

图注:不同密度(625-10,000 个细胞)条件下在 Nunclon Sphera 微孔板中生成的 SW480 球状体。在第2天和第7天使用 EVOS 7000 显微镜捕获图像。不存在 ECM 的比例图只代表出现了细胞团块而不是球状体,而使用 I 型胶原蛋白时球状体则均匀且完整。比例尺等于 650 µm。

尺寸和球度评估:

每种细胞密度往往会生成不同的球状体尺寸;因此在继续高通量实验之前,必须评估球状体的密度。下面的图表显示了在 SW480 细胞系中获得的不同球状体尺寸与其相应细胞密度。适用于 HT 检测的球状体尺寸直径约为 300-500 μm。

球度是另一种确定球状体圆度或圆形性质的现象。较大的球度可确保球状体保持完整、圆形且难以分解。

Sphericity of SW480 spheroids generated in various densities from 625 to 10,000 cells

仅供科研使用,不可用于诊断目的。