使用 CyQUANT 增殖试剂盒定量分析从 AlgiMatrix 中分离的球状体的活力

• 加湿培养箱（5% CO₂ ± 1%，36°C ± 2°C）
• 荧光酶标仪
• 55 mM 等渗柠檬酸三钠溶液

1. 用 1M 储备液制备 55 mM 柠檬酸三钠溶液
2. 用 100 g/L NaCl 溶液将柠檬酸盐溶液的渗透压调节至与培养基相同。（向溶液中添加 1 g/L NaCl 可将渗透压升高 30 mOsm）
3. 用 1M 柠檬酸溶液将 pH 值调节至 pH 7.2

1. 通过稀释 1M 储备液得到 55 mM 柠檬酸三钠溶液，并向其中添加 1 g/L 葡萄糖
2. 用 100 g/L NaCl 溶液调节渗透压（培养基的渗透压）
3. 用 1M 柠檬酸溶液将 pH 值调节至 pH 7.2 - 7.4
   
   备注：（向溶液中添加 1 g/L NaCl 可将渗透压升高 30 mOsm）。

在 AlgiMatrix 微孔板上生成球状体

以10,000、20,000、40,000和80,000个细胞/孔的密度按将一式四份将细胞铺于 AlgiMatrix 微孔板上的 100 ml 完全培养基中。 以 100 x g 的设置将微孔板离心4分钟。在 37°C 的 5% CO2 培养箱中孵育微孔板10分钟。随后向每孔中添加 130 ml 完全培养基。 培养球状体24小时。

通过传统方法分离球状体

1. 用 200 mL 移液器从 AlgiMatrix 微孔板的孔中吸出培养基。
2. 向每孔添加 200 µl 不完全培养基并在 37°C 下孵育5分钟。
3. 将海绵转移至 15 ml 锥形离心管中。
4. 向每份海绵中添加 1 ml 37°C 55 mM 等渗柠檬酸三钠溶液
5. 通过上下颠倒轻柔混匀，在室温下孵育离心管 4-5 分钟。
6. 在 25°C 下以 100 x g 的设置离心试管7分钟，弃去上清液。
7. 将球状体沉淀物重悬于完全培养基中，然后转移至具有透明底部的96孔黑色微孔板中。

球状体的原位收获

1. 吸出孔中的培养基。
2. 向每孔添加 250 µL 55 mM 预热等渗柠檬酸三钠溶液及 1 g/L 葡萄糖溶液，然后在 37°C 下孵育10分钟。
3. 在 25°C 下以 100 x g 的设置对微孔板离心4分钟。
4. 用机械移液器的切割式吸头从孔中吸出柠檬酸三钠溶液。
5. (A). 重复步骤3，并在 25°C 下以 200 x g 的设置离心微孔板8分钟
   
   （或）
   
   (B).用切割式吸头吸出溶解的 AlgiMatrix-柠檬酸盐溶液，并转移至 1.5 ml 微量离心管中，然后再以 200 x g 的设置离心试管8分钟。
6. 收集并处理球状体用于下游应用（DNA、RNA、免疫荧光和蛋白提取）。

CyQUANT GR 染色

CyQUANT GR 染料是一种核酸染色剂，可透过死细胞膜，但不能透过活细胞膜。 由于死细胞膜已经受损，CyQUANT 可进入受损细胞并嵌入核酸中。 激发波长约为 480 nm 时，其在约 520 nm 处产生荧光。

1. 将 200 µl 含 1X CyQUANT GR 染料的 1X DPBS 加入到每个含有球状体的孔中
2. 将微孔板于 37°C 下孵育10分钟
3. 于 480/520 nm 处读取微孔板的荧光值（F 最小值）
4. 向每孔添加 10 µl 20X 细胞裂解缓冲液并混匀
5. 将微孔板置于 -70°C 下保持20分钟
6. 室温下解冻微孔板并在 37°C 下孵育10分钟
7. 于 480/520 nm 处读取荧光值（F 最大值）（视为 100% 死细胞）

计算球状体活力

死球状体百分比 (%) = F 最小值/F最大值 × 100
活球状体百分比 (%) = 100 - 死球状体百分比 (%)
F 最小值 = 细胞裂解前的荧光值。
F 最大值 = 细胞裂解后的荧光值。