HPLCメソッドの開発ステップ

 
 
 
サンプル調製

 
 
 
マトリックス効果

サンプルマトリックスとは何か？

サンプルマトリックスとは、ターゲットの分析物を除いたサンプル内のあらゆる物質のことだと考えることができます。そこには塩類その他の化合物から溶媒にいたるすべてのものが含まれます。こうしたマトリックスのタイプに応じて、それに適したサンプル調製、クロマトグラフィーのモード、検出方法を選択しなければなりません。サンプルマトリックスの把握は、メソッド開発における本質的な検討事項です。

マトリックス効果とは何か？

マトリックス効果とは広範な意味を持つ用語ですが、特定の分析物マトリックスがどの程度分析物の検出や定量に影響するかの傾向を説明する際に使われます。通常この効果はバイアスとして現れ、溶液中の分析物濃度を過小ないし過大評価する原因になります。

マトリックス効果は、サンプルの調製、カラムでの分離、検出を含めた、分析時のほぼすべての段階で現れる可能性があります。次にいくつかの一般的な例を示します。

• UV吸収性化合物と目的の分析物の共溶出
• イオン化可能な分析対象物の保持係数のサンプルpHによる変化
• エレクトロスプレーイオン化における分析物のイオン抑制

干渉マトリックスの軽減法

マトリックス効果の軽減については、一般的な方法がいくつか存在します。何が正しい選択かは、分析の内容によって異なります。

分析物の感度が適切であれば、一番簡単なアプローチは、適切な注入溶媒でサンプルを希釈することです。サンプルが希薄であれば、マトリックス効果の影響も無視できるレベルに小さくなります。

その他の解決策としては分析前に抽出を行う手法もあります。これはサンプル汚染の原因となりうるものを排除することで分離能を改善します。2D-LCの使用や、より選択性の高い検出方法への切り替えによっても、マトリックス効果を回避できます。

最後に、メソッドを変更することなく標準物質を追加するという手法も存在します。ただし、サンプルあたりの注入回数が増加するため、この手法は一般的に避けられています。

 
 
 
メソッドのステップ

メソッド開発のステップ

既存の確立済みメソッドが利用できない場合は、慎重なプランニングとその実践により、堅牢な手順を開発する必要があります。HPLCおよびUHPLC用のメソッドを構築する場合、サンプル調製以外にも以下の4つの主要なステップ（英語資料へリンク）を意識しておかなければなりません。

1. メソッドのスカウティング。各種のカラムおよび溶離液条件のスクリーニングを行います。このフェーズの目的は、HPLCでの分離を成功させるために最適な組み合わせを選択することです。実際のメソッドスカウティングは、カラムと移動相の切り替えや機器メソッドの構築に関して、かなりの手作業を必要とします。ターゲットとなる化合物の特性を把握しておくことで、最初からスカウティングの候補を、最も有望な少数のカラムのみに絞り込むことができます。

2. メソッドの最適化。分解能、速度、再現性を可能な限り最大化するため、HPLCメソッドでの各種の分離条件のテストを反復して行います。このステップは、メソッド開発の中でも最も長い時間を要するパートであり、完全な解析を行うには多くの場合、専門知識が不可欠となります。

3. 堅牢性テスト。分離メソッドのパラメーター変更の影響を判断するために試験を行います。堅牢性の最適化は、メソッドの開発と検証のプロセスの多くで重要な要件です。

4. メソッドの妥当性確認。開発した分析メソッドが目的の用途に適合しているかを検証する、業界固有のプロセスです。

 

 
 
 
メソッドの自動化

メソッド開発用のハードウェア

自動メソッド開発では主として次の2つのハードウェア機能が必要とされます。

1. 自動溶媒切り替え。このテクノロジーは、手動でのボトル交換やシステムパージを不要とし、シーケンス中に移動相を切り替える能力を提供するものです。Thermo Scientific Vanquishメソッド開発システムには、外部選択バルブ付きの溶媒拡張キットが含まれており、チャネルごとに最大10種類の溶媒の自動スカウティングが行えます。

2. 自動カラム切り替え。これは初期段階のメソッド開発で用いるもので、通常は数種類の固定相の化学的性質についてスカウティングを実施します。自動カラム切り替えを利用すると、手動でのカラム間フィッティングの切り替え用にシーケンスを中断する必要性が排除され、時間とユーザーの労力の両方を節約できます。Thermo Scientific Viperメソッドスカウティングキットには、4カラムケミストリーの検証に必要なすべての流路接続とキャピラリーが含まれています。

 

メソッド開発用のソフトウェア

メソッド開発プロセスを完全に自動化するには、メソッドのスカウティングから妥当性確認までのプロセスをガイドする専用ソフトウェアが必要です。いくつかのソフトウェアパッケージには、分析物の保持能の予測からシーケンス生成までの機能が含まれています。

たとえばChromSwordAuto Chromeleon Connectでは、人工知能ベースのアプローチを用いたメソッドの最適化が行えます。ChromSword AutoRobust Chromeleon Connectでは、多変量アプローチを用いた、自動メソッドの堅牢性とシステムの安定性の評価のスリム化が行えます。どちらのオプションもChromeleonとの完全な統合がされており、高度なユーザーエクスペリエンスがもたらされます。

Thermo Scientific HPLCシステムに対応したもう1つの主要なソフトウェアパッケージとして、S-Matrix® Fusion QbD®が挙げられます。ここでのメソッド開発はクオリティ・バイ・デザインのアプローチに大きく依存しています。

 
 
 
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