スペクトルフローサイトメトリーの基礎

スペクトルフローサイトメトリーとは？

スペクトルフローサイトメトリーは、従来のフローサイトメトリーの基本的な機能の多くをベースにしているが、独自の光学系および解析機能を備えています。スペクトルフローサイトメトリーでは、特定の波長範囲にわたって、すべての蛍光分子の発光スペクトルが検出器で捕捉されます。すべての分子の蛍光スペクトルを認識し、スペクトルシグネチャーとして記録し、マルチカラー・アプリケーションのリファレンスとして使用することができます。

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研究者がスペクトルフローサイトメトリーに注目するのはなぜですか？

スペクトルフローサイトメトリー入門

フローサイトメトリーは、懸濁液中の単一細胞または粒子が単一または複数のレーザーを通過する際に、迅速なマルチパラメーター解析を可能にする技術です。各細胞または粒子は、装置の検出器によって捕捉された散乱光と複数の蛍光シグナルについて解析されます。一度に数千から数百万個の細胞について測定できるフローサイトメトリーは、最も強力なプラットフォームの1つとなっています。フローサイトメトリーによるシングルセル解析は、細胞の不均一性と単一細胞の動態を明らかにし、細胞の同定と特性解析のために、研究分野、バイオテクノロジー、バイオ医薬品、臨床のあらゆる場面で応用できます。一般的な用途としては、免疫学、感染症学、免疫腫瘍学およびがん生物学、微生物学、創薬およびバイオマーカー同定、分子生物学などがあります。免疫系の複雑性を理解し、免疫系の細胞を操作して健康増進を図りたいという欲求がますます高まっているため、ハイパラメーターの細胞ベースの検査が採用されつつあります。装置と蛍光色素の開発における最近の進歩によって、1つのサンプルでフローサイトメトリーを用いて解析できる能力が向上しパラメータ数も増えています。

スペクトルフローサイトメトリー開発の歴史

フローサイトメトリーは、単一の蛍光パラメーターを測定できる最初の市販フローサイトメーターが1970年代初頭に登場して以来、何十年にもわたって発展してきました[1]。1970年代後半になると、2本のレーザーを搭載した装置が設計され、細胞の測定と定量化だけでなく、細胞のソーティングができるように改良されました[2].。フローサイトメトリー技術の継続的な発展により、レーザーと検出器の数が増え、より多くのパラメーターを検出できるようになりました[3-5]。最近では、5本のレーザーを搭載したフローサイトメーターで28の蛍光パラメーターを検出できるようになりました[6]。

検出能力が大幅に向上したにもかかわらず、蛍光スペクトル全体にわたる測定には大きな関心が寄せられ、分光蛍光光度計と同様の性能を持つフローサイトメーターの開発が進められてきました。このような取り組みにおける主なハードルは、単一粒子測定に必要な信号積分時間が短いことでした。光学系と検出器の進歩により、フローサイトメトリー測定に通常使用されるマイクロ秒単位の時間スケールでのスペクトル測定が可能になりました[7]。

フローサイトメトリーを利用したスペクトルアプローチは、2004年にパデュー大学のRobinsonグループによって初めて報告されました[8-10]。ソニー・バイオテクノロジーは、2012年にプリズムと光を集めて増幅する光電子増倍管(PMT)を用いた初の商用スペクトルフローサイトメーターを発売しました。Cytek Biosciences、BD Biosciences、サーモフィッシャーサイエンティフィックなどの複数の企業も、さまざまなシグナル検出および増幅システムを使用して、スペクトルフローサイトメーターとスペクトルセルソーターを開発しています。

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近年、スペクトルフローサイトメトリー解析により、研究者や科学者はますます多くの興味ある分子を調べることができるようになりました。フローサイトメトリーとセルソーティングの最新技術について、この記事集をご覧ください。

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スペクトルと従来のフローサイトメトリーの比較

従来のフローサイトメトリーの基本コンセプトの多くは、スペクトルフローサイトメトリーに容易に変換できます[11-12]。サンプルの取り込みと送達には、一般的に陽圧または真空駆動システムが使用され、サンプル検出の基本的な物理原理は変わりません。単細胞懸濁液は、一定の圧力で流れる乱流のないシース流体中に注入されます。シースとサンプル間の圧力差により、単一の列に細胞が集束し、これを流体力学的集束（ハイドロダイナミックフォーカシング）と呼びます。アコースティックハイドロダイナミックフォーカシングは、ハイドロダイナミックフォーカシングと細胞をより正確に整列させるために音波を発生させるピエゾデバイスを組み合わせた最近の開発です[13]。

従来の装置もスペクトル装置も、光検出器として光電子増倍管（PMT）またはアバランシェフォトダイオード（APD）を利用することができます。APDはPMTよりも量子効率が高く、650 nm以上の波長で性能が向上し、赤色および近赤外検出が強化されます。生物学的測定では、PMTとAPDは可視波長領域で同様の性能を発揮します[14]。

フローサイトメトリーパネルのデザインは、装置構成、適合する蛍光色素、生体系におけるマーカーの発現レベル、解析ストラテジーを理解することに依存します[15]。一般に、スペクトルフローサイトメトリーのパネルデザインは、ゲーティングストラテジー、蛍光色素の輝度と抗原密度のマッチング、スピルオーバー拡散エラーの特徴と最小化、実験的および技術的コントロールの体系的な使用など、従来のフローサイトメトリーと同じ原則に従います。しかし、スペクトルパネルの開発にはさらなる考慮が必要です[12]。最後に、従来のフローサイトメトリーと同様に、スペクトルフローサイトメーターで生成されたデジタル化された情報は、フローサイトメトリースタンダード（FCS）ファイルとして保存され、統計的に解析されて細胞の特性が報告されます。

	従来のフローサイトメトリー	スペクトルフローサイトメトリー
特定の蛍光色素の検出波長範囲	最大発光付近	~350～900 nm
検出器数／蛍光色素の数	1	複数
スピルオーバー補正方法	補正（コンペンセーション）	アンミキシング
蛍光色素の選択	光学構成による制限	蛍光色素のスペクトルシグネチャーの特異性による制限
自家蛍光の抽出	なし	あり

表1.従来のフローサイトメトリーとスペクトルフローサイトメトリーの主な特徴の比較。

詳細を見る：フローサイトメトリ―の基礎

スペクトルと従来のフローサイトメトリーの違い

従来型とスペクトルフローサイトメーターの違い:

光検出器に照射される光の帯域幅
蛍光色素ごとに使用する検出器の数
蛍光色素と別の蛍光色素を分離するアルゴリズム

従来のフローサイトメトリーでは、各蛍光色素は1つのターゲット検出器で測定され、バンドパスまたはロングパスの光学フィルターを用いて全発光の一部を収集します。その検出器で発光する可能性のある他の蛍光色素からのスピルオーバーは、コンペンセーションを用いて補正されます（図1）。

Comparison of conventional and spectral flow cytometry optical detection.

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図1.従来のフローサイトメトリーとスペクトルフローサイトメトリーの光学検出の比較。（A）従来のコンペンセーションベースのフローサイトメーターは、1つの検出器を用いて1つの主要な蛍光色素からの蛍光発光を収集し、発光の一部分のみを収集します。（B）スペクトルアンミキシングベースのフローサイトメーターは、マルチレーザー励起を使用してすべての蛍光色素のフルスペクトル蛍光発光を収集するために複数の検出器を使用します。

対照的に、スペクトルフローサイトメトリーでは、複数の検出器を用いて、システムで使用される複数のレーザーにわたるすべての蛍光色素のフルスペクトル発光を測定し、各蛍光色素のより詳細なシグネチャーを作成します。各グループまたはアレイによって検出されたスペクトルは、スペクトルシグネチャを形成します（図2）。従来のフローサイトメトリーが蛍光のスピルオーバーを補正するためにコンペンセーションを用いるのに対し、スペクトルフローサイトメトリーは各蛍光体を識別するためにアンミキシングと呼ばれるプロセスを用います。スペクトルアンミキシングは、各蛍光色素の固有のスペクトルシグネチャーに基づいて、マルチカラーサンプル内の多くの蛍光色素シグネチャーを区別する数学的アルゴリズムを使用します。この方法によって、ピーク発光はほぼ同じだが、オフピーク発光が異なる蛍光色素を区別し、パネルで一緒に使用することができます。最後に、ほとんどの分光システムで信号分解能を向上させるために、蛍光信号から細胞の自家蛍光を抽出することができます[1,16]。

A. Cytek AuroraのInvitrogen Brilliant Ultra Violet 737色素

Examples of the spectral signatures of NovaFluor Blue 585 and Brilliant Ultra Violet 737.

図をクリックして拡大

B. Invitrogen BigfootでのInvitrogen Brilliant Ultra Violet 737色素

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図2.スペクトルシグネチャー。蛍光体のスペクトルシグネチャーは、マルチレーザー励起の結果でです。これらの例では、個々のレーザーに関連する各検出器セットが、固有のシグネチャに寄与しています。（A）5本のレーザーを搭載したCytek AuroraスペクトルフローサイトメーターによるInvitrogen Brilliant Ultra Violet 737色素のスペクトルシグネチャーを示しています。（B）7本のレーザーを搭載したInvitrogen Bigfoot Spectral Cell Sorterを用いて、Invitrogen Brilliant Ultra Violet 737色素のスペクトルシグネチャーを示しています。

探索する：イムノフェノタイピング用NovaFluor色素
探索する：Brilliant ultra violet polymer色素

スペクトルフローサイトメトリーの利点

1つのサンプルから得られる情報を最大限に生かしたいという研究者の願望は、装置の進歩と蛍光色素の利用可能性の増大をもたらしました。適切に設計されたパネルがあれば、スペクトル型フローサイトメーターも従来のフローサイトメーターも高解像度のデータを生成することができます。しかし、研究者がより多くのパラメーターを評価したい場合、スペクトルフローサイトメトリーは、フルスペクトルとしてデータを収集・処理することで、より多くの個々の蛍光色素を分解することができます。これにより、従来のフローサイトメーターでは使用不可能であった、より多くの既存の蛍光色素を使用することができ、40の蛍光パラメーターを超えるイムノフェノタイピング・パネルの拡張が可能になります[17,18]。

さらに、スペクトルフローサイトメーターでは、細胞の自家蛍光を、あたかもパネル内の別の蛍光色素であるかのように、別のパラメータとして測定することができます。自家蛍光によるバックグラウンドの影響を考慮することで、標的特異的蛍光シグナルの分解能を向上させることができる。スペクトルフローサイトメトリーでは、蛍光色素ごとに多くの情報が得られるため、分解能と感度が向上し、発光極大は似ているがオフピーク発光が異なる蛍光色素をアンミキシングで区別することができます。これにより、パネルデザインにおいて、より大きな柔軟性と能力が提供されます。

スペクトルフローサイトメトリーとセルソーティングの技術を用いて、研究者たちは新しいマーカーの組み合わせに基づいて細胞を同定し、選別することができるようになりました。しかし、パネルデザインの複雑化と複雑なサブセットの特性評価には、パネルデザイン、結果の正確な解析、標準化されたプロトコルのための専門知識の向上が必要です。[19]パラメーターの数を増やすことで、免疫細胞とサブセットの特徴をより深く解明できる可能性があります。