トランスフェクション効率が低い

考えられる原因推奨される解決方法
血清を含む培地、または血清の存在下で形成した複合体を含む培地中で、プラスミド DNA、siRNA、またはトランスフェクション試薬を希釈したプラスミド DNA、siRNA、およびトランスフェクション試薬を希釈には無血清培地を使用します。

注：複合体を形成させる前に、Opti-MEM | Reduced Serum Medium（カタログ番号 31985-062）を使用して Lipofectamine 2000 と DNA を希釈することをお勧めします。
細胞株に最適ではないDNA：トランスフェクション試薬比
ほとんどの細胞で、DNA（μg）：Lipofectamine2000（μL）の比を 1：2 ～ 1：3 にして複合体を調製します。最適化が必要な場合もあります。その場合、DNA（μg）Lipofectamine 2000（μL）の比を 1：0.5 ～ 1：5 に変えてみます。別のトランスフェクション試薬を使用する場合は、製品マニュアルを参照してください。
希釈時間、または複合体を形成させるインキュベーション時間が短すぎる
Lipofectamine 2000 の場合、DNA とトランスフェクション試薬を別々に希釈して 5 分間インキュベートすることを推奨しています。希釈した各試薬を混ぜ合わせて 20 分間インキュベートすることで最適な効率が得られます。
希釈または複合体の形成に用いるプラスミド DNA の不足2 番目の方法で使用している濃度を確かめます。または DNA が分解していないかどうか確認します。分光光度計で A260／A280 値を測定、または Quant-iT™ DNA Assays Kit（Q33130、Q33120）を用いてDNA 濃度を測定します。
トランスフェクションに用いるプラスミド DNA または siRNA が分解している、あるいは品質不良である
トランスフェクションに用いるプラスミド DNA または siRNA が高品質であることを確認します。プラスミド DNA 精製キットには、PureLink™ HiPure Nucleic Acid Purification Kit の使用をお勧めします。
細胞密度が最適でないLipofectamine 2000 は、トランスフェクション時に 90％を超えるコンフルエンスの培養でもっとも機能します。細胞密度が低い状態（<70％）で扱う場合は、代替として Optifect™ Transfection Reagent をお勧めします。
複合体を無血清培地に入れた細胞に添加
トランスフェクションを行うときは、血清を含む増殖培地を使用してみてください。細胞の生存率が高いほど、トランスフェクション効率は通常良好になります。無血清条件が必須の場合、一部の無血清製剤（CD293、SFM II、VP-SFM など）はカチオン性脂質媒介性トランスフェクションを阻害することがあるため、Lipofectamine 2000 に適合する培地で試験します。
阻害剤が培地中に存在する増殖培地や DNA：トランスフェクション試薬複合体の調製に用いる培地に、抗生物質、EDTA、クエン酸塩、リン酸塩、RPMI、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、または他のプロテオグリカン硫酸塩を使用しないでください。
効率や発現の測定に用いるアッセイに関する問題レポーター遺伝子を用いてトランスフェクション効率を測定します。レポーター遺伝子のコントロールにより、発現を確認できます。
ベクター上のプロモーター・エンハンサーが細胞タイプによって認識されないベクターコンストラクトのプロモーター・エンハンサーが目的の細胞タイプに対応することを確認します。
細胞が時間とともに変化する、または分割条件が変化したトランスフェクション効率が急激に低下した場合、細胞が原因である可能性があります。一貫したスケジュールで、細胞が希薄にまたは集密になり過ぎないように細胞を分割、播種することをお勧めします。過剰な継代もトランスフェクション効率を低下させます。この場合、液体窒素に保存した細胞の新しいバイアルから始めます。
トランスフェクション試薬の不適切な保存トランスフェクション試薬を4°C で保管することを推奨しています。トランスフェクション試薬を凍結または室温で保存すると、活性が低下するおそれがあります。

トランスフェクション後に細胞生存率が低下

考えられる原因
推奨される解決方法
細胞株に最適ではないDNA：トランスフェクション試薬比
ほとんどの細胞で、DNA（μg）：Lipofectamine 2000（μL）の比を 1：2 ～ 1：3 にして複合体を調製します。最適化が必要な場合もあります。その場合、DNA（μg）：Lipofectamine 2000（μL）の比を 1：0.5 ～ 1：5 に変えてみます。
プラスミド DNA 調製液に高レベルのエンドトキシンが含まれるトランスフェクションに用いるプラスミド DNA または siRNA が高品質であることを確認します。プラスミド DNA 精製キットには、PureLink™ HiPure Nucleic Acid Purification Kit の使用をお勧めします。
細胞密度が最適でない
Lipofectamine 2000 は、トランスフェクション時に 90％コンフルエンスを超える培養で、もっとも機能します。細胞密度が低い状態（<70％）で扱う際に、発現レベルよりも細胞生存率が重要な場合、代替として Optifect™ Transfection Reagent をお勧めします。
複合体を無血清培地に入れた細胞に添加
トランスフェクションを行うときは、血清を含む増殖培地を使用してみてください。細胞の生存率が高いほど、トランスフェクション効率は通常良好になります。無血清条件が必須の場合、一部の無血清製剤（CD293、SFM II、VP-SFM など）はカチオン性脂質媒介性トランスフェクションを阻害することがあるため、Lipofectamine 2000 に適合する培地で試験します。
複合体と増殖培地が十分に混ざっていない
トランスフェクション試薬を培地に添加した後、ウェル内でDNA：トランスフェクション試薬複合体の凝集を防ぐためプレートやウェルを十分に混合してください。
細胞が時間とともに変化した、または分割条件が変化したトランスフェクション効率が急激に低下した場合、細胞が原因である可能性があります。一貫したスケジュールで、細胞が希薄にまたは集密になり過ぎないように細胞を分割、播種することをお勧めします。過剰な継代もトランスフェクション効率を低下させます。この場合、液体窒素に保存した細胞の新しいバイアルから始めます。
トランスフェクション時に抗生物質を増殖培地に添加したトランスフェクション中の細胞は抗生物質を取り込みやすく毒性を生じるおそれがあるため、クロロキン、ペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質を増殖培地に使用しないでください。
トランスフェクション試薬の不適切な保存トランスフェクション試薬を 4°℃で保存することを推奨しています。トランスフェクション試薬を凍結または室温で保存すると、活性が低下するおそれがあります。
カチオン性脂質試薬が酸化したカチオン性脂質試薬をボルテックスにかけたり、過度に撹拌したりしないでください。カチオン性脂質試薬の過酸化物が形成されるおそれがあります。
選択用抗生物質の添加が早過ぎる安定した細胞株を作製する場合、選択用抗生物質を添加する前に細胞が耐性遺伝子を発現するまで少なくとも 72 時間お待ちください。

トランスフェクション結果の再現性がとれない

考えられる原因
推奨される解決方法
細胞が時間とともに変化した、または分割条件が変化したトランスフェクション効率が急激に低下した場合、細胞が原因である可能性があります。一貫したスケジュールで、細胞が希薄にまたは集密になり過ぎないように細胞を分割、播種することをお勧めします。過剰な継代もトランスフェクション効率を低下させます。この場合、液体窒素に保存した細胞の新しいバイアルから始めます。
異なるコンフルエンシーの細胞やまたは異なる DNA：トランスフェクション試薬比でトランスフェクションを実施した
トランスフェクション効率の再現性は、一貫したプロトコル（同じDNA：トランスフェクション試薬比）で細胞の分割、播種、トランスフェクションの日常的な一貫性に左右されます。異なる DNA 調製法や培地の変更によってもトランスフェクション効率が変わる可能性があります。

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.