PCRのセットアップで考慮すべき6つの要素

複製用のPCRテンプレートとしては、ゲノムDNA（gDNA）、cDNA、プラスミドDNAなどあらゆるDNAソースを用いることができます。しかし、DNAの組成や複雑性の違いによりPCRに必要な最適投入量はそれぞれで異なります。例えば、50µL PCRの開始量としてプラスミドDNAの場合、0.1～1 ngで十分である一方、gDNAの場合、5～50 ng必要です。最適なテンプレート量はまた、使用するDNAポリメラーゼの種類によって大きく異なります。テンプレートへのアフィニティを高めた組換えDNAポリメラーゼを使用すると、DNA投入量は少量で済みます。DNA投入量が多い場合には非特異的増幅のリスクが高まり、一方少ない量では収量が低くなるため、DNA投入量の最適化は重要です（図1）。

特にgDNAを用いる場合など、コピー数を基準としてDNA投入量を決める場合があります。コピー数計算は、添加したDNAに存在する分子数から算出されます。アボガドロ定数（L）およびモル数を用いると、コピー数は次のように計算できます。

コピー数 = L xモル数 = L x（全質量／分子質量）

特定のDNA鎖の分子質量は、鎖のサイズまたは全塩基数（すなわち、長さおよび一本鎖か二本鎖かの情報）で決定されます。オンラインツールを用いて、DNA量から勘弁にコピー数を計算することができます。

理論的には、理想的な条件下ではDNA1コピーまたは1つの細胞からPCRを行えます。しかし実際には、特定のテンプレートの増幅効率は反応成分やパラメーター、およびDNAポリメラーゼの感度の影響を受けます。

gDNA、cDNA、プラスミドDNAの他に、PCR産物を再増幅してターゲットを高収量で得ることが可能です。未精製の産物がテンプレートとして直接使用されることもありますが、プライマー、dNTP、塩類、副生成物などが増幅に悪影響を及ぼすことがあります。そのような阻害を避けるため、一般的には次のPCRの前に水で反応液を希釈することが推奨されます。また、最良の結果を得るためには、PCR産物を精製してください。最適化されたPCR精製キットによるPCRクリーンアップはわずか5分で終了します。

DNAポリメラーゼは標的DNAの増幅に関わる重要な因子です。Taq DNA ポリメラーゼはほぼ間違いなくPCRにおいて最も知られた酵素であり、その発見により、PCRに革命が起きました。Taq DNAポリメラーゼは比較的耐熱性に優れ、95°Cでの半減期はおよそ40分です[1]。70°Cの条件で、60塩基/秒の速度でヌクレオチドを取り込み、約5 kbの長さまで増幅できるので、標準的なPCRに適しています。最近、大幅に性能が改善された次世代DNAポリメラーゼが設計されました。

一般的な50 µLの反応系では、1～2ユニットのDNAポリメラーゼが標的DNA増幅に使用されます。しかし、増幅困難なテンプレートの場合、酵素量の調整が必要になります。例えば、DNAサンプルに阻害物質が含まれる場合、DNAポリメラーゼの量を増やせばPCR収量が増大する場合があります。しかし、非特異的PCR産物は酵素濃度が高くても現れることがあります（図2）。

PCRクローニング、長鎖DNAの増幅、GCリッチPCRなどの特別な用途には、高性能DNAポリメラーゼが適しています。こうした酵素は、高収量かつ阻害剤に対する高い耐性を持ち、エラー率の低いPCR産物を長いテンプレートから短時間で生成することができます（詳細は、「DNAポリメラーゼの特性」を参照）。

PCRプライマーは約15～30塩基の合成オリゴDNAです。PCRプライマーは、テンプレートDNA中の目的領域に隣接する配列に（相補的に）結合するよう設計されています。PCRの間、DNAポリメラーゼはプライマーの3′末端からヌクレオチドを伸長します。よって、目的ターゲットを特異的に増幅するためには、プライマーはターゲットの末端に特異的に結合し、鋳型DNAの他の部分とのホモロジーは可能な限り低くする必要があります。

配列の相同性に加えて、プライマーはPCR増幅の特異性以外点にも留意して、慎重に設計する必要があります。まず、プライマー配列のT_m値は55～70°Cの範囲で、2つのプライマーのT_m値が5°C以内でなければなりません。同様に重要なことは、プライマー同士の相補性、およびリピート配列を持たないように設計する必要がことです。プライマー同士、特に3’末端に相同性があると、プライマー同士がアニーリングし、プライマーダイマーを増幅する可能性があります。また、リピート配列は、二次構造形成’を促し、ターゲットとのアニーリングを阻害する可能性があります。

さらに、プライマーのGC含量は理想的には40～60%で、CおよびGの分布に偏りが無いことがミスプライミング回避には必要です。同様に、非特異的プライミングを最小化するため、3個以上のGまたはC塩基がプライマーの3'末端に存在しないようにしてください。他方、プライマーの3'末端に1個のCまたはGヌクレオチドがあると、正確なアニーリングおよび伸長には有利です（表1）。最適なプライマー配列をバイオインフォマティクス的に設計、選択するオンラインツールを利用できます。

表1. PCRプライマー設計における一般的な推奨事項。

長い配列のプライマー（例：50 ntより大きい）および修飾プライマーの場合、しばしば 精製して、短いオリゴや非修飾オリゴを除去する必要があります。プライマーの精製は、配列と長さの完全性が実験成功に欠かせないクローニングや変異導入などのアプリケーションに推奨されます。

PCRクローニング用にプライマーを設計する場合、制限酵素認識部位、組換え配列、プロモーター配列などの非アニーリング配列は5′末端付加されます。こうした付加配列はPCR増幅やダウンストリームアプリケーションへの影響を最小限にするよう、慎重に設計する必要があります（詳細は、「PCRクローニング」を参照）。

PCR用反応液には、0.1～1 μMの範囲で反応にプライマーを加えます。縮重プライマーやロングPCRに使われるプライマーは、0.3～1 μMの濃度が望ましい場合が多くあります。一般的に推奨されるのは、標準的な濃度で試し、その後必要に応じて調整することです。プライマー濃度が高いと、ミスプライミングや非特異的増幅の原因になります。他方、プライマー濃度が低いと、対象ターゲットの増幅が低いかゼロという結果になることがあります（図3）。

図3. 様々なプライマー濃度におけるヒトgDNAのPCR増幅  GCリッチ配列を持つ0.7 kbの断片増幅を試みた。 非特異的産物およびプライマーダイマーが高いプライマー濃度で蓄積している。

dNTPはdATP、dCTP、dGTP、dTTPのヌクレオチド4つからなり、DNA鎖の基本単位です。この4つのヌクレオチドは一般に等モル量でPCR反応に加えられます。しかし、PCRによるランダム変異導入を行う場合は、dNTP濃度の不均衡をわざと生じさせ、プルーフリーディング活性を持たないDNAポリメラーゼによる高効率な取り込みミスを促進します。

通常のPCRアプリケーションでは、各dNTPの推奨される最終濃度は一般に0.2 mMです。高濃度が有効なケース（特に高濃度のMg²⁺が存在する場合）もありますが、それはMg²⁺ がdNTPに結合し、取り込みの有効性を低減するためです。しかし、最適濃度を越えたdNTPはPCRを阻害します。有効なDNAポリメラーゼによる取り込みを実現するには、反応中に遊離dNTPが0.010～0.015 mM（推定K_m値）以上の濃度で存在しなければなりません（図4）。プルーフリーディング活性がないDNAポリメラーゼを使用する場合、dNTP濃度を低げ（0.01～0.05 mM）、同時にMg²⁺を同じ比率で下げることでフィデリティを向上できます。

アプリケーションによっては、dNTPミックスに特殊なヌクレオチドが含まれることがあります。例えば、dTTPをデオキシウリジン三リン酸（dUTP）で置換したものを使用し、その後ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）で処理する方法があります。これはPCR汚染のキャリーオーバーを防ぐ方法です［2］。UDGはDNA修復酵素で、ウラシルを含むDNA鎖を切断します。dTTPをdUTPで置換することで、ウラシルを含むPCR産物を生成できます。UDGを含む反応液をPCR開始前にインキュベーションすると、ウラシルを含む汚染されたキャリーオーバーPCRアンプリコンが除去され、キャリーオーバーPCR産物から偽陽性反応を防ぐことができます（図5）。

図5. PCRアンプリコン汚染のキャリーオーバーを防ぐためのUDG処理。 UDGはDNA断片に含まれるウラシル塩基（赤の棒）を切除する。 脱塩基DNA鎖はPCR条件下で分解しやすく、それに続くPCRで増幅されない。

PCRでdUTPを用いるには、考慮すべき定説がいくつかあります。まず、dUTP置換はPCRの効率と感度を下げる可能性があるというものです。この難問は、dUTPに対してdTTPを最適な割合で混合することで各PCR産物の分子が効率的なUDG処理に十分なウラシル塩基を持つようにし、かつPCR効率を大幅に干渉しないようにして克服できることがあります。2つ目として、Taq DNAポリメラーゼはDNA合成中にdUTPを取り込みますが、Pfu などのプルーフリーディングDNAポリメラーゼは特にウラシルを取り込むよう改良されない限り、dUTP使用できないというものです。この特質はArchaea由来のDNAポリメラーゼは、DNA修復機構の一つとしてウラシル結合ポケットを持つためです［3、4］。

同様に、アミノアリル-dUTP、フルオレセイン-12-dUTP、5-ブロモ-dUTP、ビオチン-11-dUTPなどの修飾dNTPが、後続の実験で必要な標識導入のために汎用使用されます。dUTPと同様に、PCRを成功させるには修飾dNTPをDNAポリメラーゼに取り込ませる必要があります。

マグネシウムイオン（Mg²⁺）はdNTPの取り込みを可能にすることで、DNAポリメラーゼ活性の補因子として機能します。酵素活性部位のマグネシウムイオンはプライマーの3′-OHとdNTPのリン酸基の間のホスホジエステル結合形成を触媒します（図6）。加えて、Mg²⁺はリン酸主鎖の負電荷を安定化させることで、プライマーおよびDNAテンプレート間の複合体形成を促進します（図8）［5］。

Mg²⁺イオンは一般的にPCR反応液にMgCl₂溶液を添加することにより供給されます。しかし、Pfu DNA ポリメラーゼ等幾つかのポリメラーゼにはMgSO₄が適しており、これは硫黄が、ある条件下ではより強力で再現性のある性能を発揮するからです。マグネシウム濃度はPCR収量を最大化するためにしばしば最適化が必要です。

一般的なPCR中のMg²⁺ の最終濃度は1～4 mMの範囲で、0.5 mM間隔での最適化が推奨されます。Mg²⁺濃度が低いとPCR産物が少量または全く得られない結果となりますが、これはポリメラーゼ活性が低下したためです。他方、Mg²⁺濃度が高いと、プライマー―テンプレート複合体の安定性が高まることで非特異的PCR産物が生成されることが多く、同時にdNTPの取り込みミスによるエラーも増加します（図7）。

PCRはDNAポリメラーゼ活性に適した化学的環境を提供するバッファー中で行います。バッファーpHは通常8.0～9.5で、緩衝剤としてはTris-HClをよく用います。

Taq DNAポリメラーゼの場合、バッファー中の一般的な構成要素はKCl由来のカリウムイオン（K⁺）で、プライマーアニーリングを促進します。場合によっては、硫酸アンモニウム(NH₄)₂SO₄がバッファー中でKClの代わりとなることがあります。アンモニウムイオン（NH₄⁺）は特にミスマッチなプライマー―テンプレート塩基対間の弱い水素結合を不安定化する効果があり、そのため特異性を高めます（図8）。

図8. DNA2本鎖形成におけるイオンの影響。 カリウムおよびマグネシウムイオンは（K⁺およびMg²⁺）、DNA主鎖のリン酸基（P^–）に結合して2本鎖形成を安定化し、一方アンモニウムイオン（NH₄⁺）は塩基（N）間の水素結合と相互作用し、2本鎖形成を不安定化します。
 

Mg²⁺はK⁺と似た安定効果を持つため、推奨されるMgC₂濃度は一般にKClバッファー（1.5±0.25 mM）使用時は少し低くなり、(NH₄)₂SO₄ バッファー（2.0±0.5 mM）使用時は少し高くなります。NH₄⁺およびMg²⁺の拮抗作用のため、(NH₄)₂SO₄を含むバッファーは幅広いMg²⁺ 濃度条件下で高いプライマー特異性を提供します（図9）。最適なPCRバッファーは使用されるDNAポリメラーゼに依存して変化するため、酵素メーカーの推奨バッファーを使用することは重要です。

図9. 異なる2つのバッファー使用時のPCR結果のMgCl₂濃度依存性。この結果は、PCRの特異性にバッファーの選択が重要であることを示している。0.95 kbの断片をヒトgDNAから Taq DNAポリメラーゼで増幅した。
 

あるケースでは、ミスプライミングを減らして増幅特異性を向上させるため、あるいは二次構造を除去することで増幅効率を向上させるために、添加剤や共溶媒がバッファーに添加されることがあります（表2）。加えて、DNAポリメラーゼには、DNAポリメラーゼおよびPCRバッファー用に最適化された専用のエンハンサーが添付されているものもあります。このような試薬はGCリッチなテンプレートなど、増幅困難なサンプルによく使用されます。添加物または共溶媒は、プライマーアニーリング、テンプレート変性、Mg²⁺結合、酵素活性に影響します。また、これらはある種のダウンストリームアプリケーションに干渉することがあります。例えば、マイクロアレイ実験における非イオン性界面活性剤などです。そのため、PCRおよびダウンストリームでの使用を成功させるには、バッファー組成を知ることが重要です。

表2. PCRエンハンサーとして用いられる一般的な添加物や共溶媒、およびその推奨される最終濃度［6］。

1. Pelt-Verkuil EV, Belkum AV, Hays JP (2008) Principles and Technical Aspects of PCR Amplification. Dordrecht: Springer.
2. Longo MC, Berninger MS, Hartley JL (1990) Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93(1):125–128.
3. Slupphaug G, Alseth I, Eftedal I et al. (1993) Low incorporation of dUMP by some thermostable DNA polymerases may limit their use in PCR amplifications. Anal Biochem 211(1):164–169.
4. Lasken RS, Schuster DM, Rashtchian A (1996) Archaebacterial DNA polymerases tightly bind uracil-containing DNA. J Biol Chem 271(30): 17692–17696.
5. Steitz TA (1998) A mechanism for all polymerases. Nature 391(6664):231–232.
6. Bartlett JMS, Stirling D (2003) PCR Protocols. In: Methods in molecular biology (2nd ed). Totowa: Humana Press.