長い断片のクローニング | Thermo Fisher Scientific

TOPO XL-2 Complete PCR Cloning Kit

長いDNA断片のクローニングの限界を克服

長い断片のクローニングは、従来の分子生物学試薬では限界があるなど、多くの理由から課題とされています。Invitrogen™ TOPO™ XL-2 Complete PCR Cloning Kit には、これらの限界を克服し、最長13 kbまでの長いPCR産物の正確、効率的、かつシンプルなクローニングを可能とするのに必要な全ての試薬が含まれます。新しい直鎖状のトポイソメラーゼI–活性化pCR™-XL-2-TOPO™ベクターを利用すると、わずか5分のベンチトップ反応で高いクローニング効率を達成できます。本ベクターは、Invitrogen™ Platinum™ SuperFi™ Green PCR Master Mixによって生成したハイフィデリティな平滑末端のPCR断片に対応します。

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キットの内容
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利点
リソース – 製品マニュアルおよびサポート

キットの内容

Complete PCR Cloning Kitに含まれるもの：

TOPO XL-2 PCR Cloning Kit—pCR™-XL-2-TOPOベクターを含有
Platinum SuperFi Green PCR Master Mix—高い正確性で長いアンプリコンを生成する、高いDNA鎖伸長能（processivity）を持つプルーフリーディングDNAポリメラーゼ（>Taq ポリメラーゼの100倍以上のフィデリティを持つ）、およびPCR産物をアガロースゲルに直接ロードし、ゲル上での分離・抽出を可能とする不活性の沈降剤を含有
PureLink™ Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo Kit—30分以内のアガロースゲルからのDNA断片精製、シリカベースのスピンカートリッジを使用するダイレクトPCR精製のために設計
One Shot™ OmniMAX™ 2 T1^R Chemically Competent E. coli Cells—全てのクローニングアプリケーションに最適な、改良型の高い形質転換効率を持つケミカルコンピテント細胞株

図 1.pCR-XL-2-TOPO ベクター

pCR-XL-2-TOPOベクター (図1) の特徴：

ポジティブセレクション用にccdB遺伝子が搭載されています。
EcoRI部位はPCR産物の挿入部位に隣接するため、インサート配列を簡単に切り出せます。
E. coli での選別用にアンピシリンおよびカナマイシン耐性遺伝子が選択可能です。
T7プロモーター/プライマー領域の搭載により、in vitro転写が可能です。
シーケンシング用のT7、T3、およびM13フォワード/リバースプライマー領域が搭載されています。

TOPO XL-2 Complete PCR Cloning Kitの利点

長い断片のクローニング効率の向上に最適

TOPO XL-2 Complete PCR Cloning Kitは、図2、3、および4に示されているように、非常に長いPCR断片のクローニングを最も高い効率で実現するように最適化されています。

The TOPO XL-2 Complete PCR Cloning Kit has superior cloning efficiency for a broad range of different sizes of targets.

図 2.TOPO XL-2 Complete PCR Cloning Kitは、幅広いさまざまなサイズのターゲット配列において、優れたクローニング効率を示します。TOPO XL-2クローニングキットを使用して、1 kb~13 kbのλゲノムDNA由来のPCR断片をクローニングしました。

The TOPO XL-2 cloning kit shows superior cloning efficiency compared to the TOPO XL kit.

図 3.TOPO XL-2クローニングキットは、TOPO XLキットよりも優れたクローニング効率を示します。それぞれのキットの推奨プロトコールに従い、7 kbのコントロールインサートをクローニングしました。

図 4.TOPO XL-2クローニングキットは、幅広いターゲットサイズにおいて、キットI（C社製）よりも優れたクローニング効率を示します。それぞれのキットに付属するマニュアルのプロトコールに従い、ヒトおよびλゲノムDNAターゲットをクローニングしました。クローニング効率は、クローニングされたターゲットの3 kb（ヒト）または～5 kb（λ）の領域を増幅する内部プライマーを使用するコロニーPCRによって決定しました。キットIに含まれるハイフィデリティポリメラーゼ酵素は、10 kbのヒトDNAターゲットを増幅できませんでした。（“インサートの配列の正確性および特異性を向上”の項目の図7のを参照してください。）

インサートの配列の正確性および特異性を向上

Platinum SuperFi DNA Polymeraseは、プルーフリーディング活性を有するDNAポリメラーゼです。優れたフィデリティと信頼性の高いInvitrogen™ Platinum™ホットスタートテクノロジーを組み合わせることで、PCRにおいて卓越した結果が得られるように設計されています。>Taqポリメラーゼの100倍以上のフィデリティを特徴とする本酵素は、TOPO XL-2 PCR Cloning Kit内のPlatinum SuperFi Green PCR Master Mixに含まれています。本製品は、クローニング、突然変異誘発、および長いDNA断片などの精度の高いシーケンスが必要とされるアプリケーションに最適です。

Platinum SuperFi DNA Polymerase exhibits superior fidelity.

図5.Platinum SuperFi DNA Polymeraseは、優れたフィデリティを発揮します。数種類のDNAポリメラーゼの相対的フィデリティ値を比較しました。ポリメラーゼのフィデリティは、次世代シーケンサを用いて測定しました。PCRフリーのライブラリーシーケンスデータから、実験誤差のバックグラウンドレベルの推定を行いました。各ポリメラーゼのフィデリティは、Taq ポリメラーゼを基準に相対値を算出しました。

Platinum SuperFi DNA Polymerase has higher specificity in amplifying larger targets than the Invitrogen Elongase Enzyme Mix.

図 6.Platinum SuperFi DNA Polymeraseは、長いターゲットの増幅において、Invitrogen™ Elongase™ Enzyme Mixよりも高い特異性を示します。PCRサイクルパラメータ用の製造元のスタンダードに続いて、1 kb、3 kb、7 kb、10 kb、および13 kbの長さのλゲノムDNA ターゲットを増幅しました。Elongase Enzyme MixはTOPO XL PCR Cloning Kit用に推奨されます。また、Platinum SuperFi DNA PolymeraseはTOPO XL-2 Complete PCR Cloning Kitに付属しています。

Platinum SuperFi DNA Polymerase shows greater specificity for both human and lambda gDNA targets than Clontech’s high-fidelity (HiFi) polymerase.

図7.Platinum SuperFi DNA Polymeraseは、ヒトgDNAターゲットおよびλgDNAターゲットのいずれにおいても、Clontech社のハイフィデリティ（HiFi）ポリメラーゼよりも高い特異性を示します。増幅は、製造元の推奨プロトコールに従いました。50 µLのPCR反応液から、それぞれ6.5 µLのヒトgDNA ターゲット、および4 µLのλgDNAターゲットを1％アガロースゲルにロードし、電気泳動後のゲルをEtBrで染色しました。

DNA 収量が向上

PureLink™ Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo Kitは、1つのキットでゲル抽出とPCR精製を迅速に行うことを可能とします。分離したDNA は、その後すぐにクローニングに使用できます。TOPO XL-2 Complete PCR Cloning Kit内にPureLinkキットが含まれることによってハンドリング操作が減少するため、全DNA収量が大幅に向上します。これは、非常に長いDNA断片を処理する際に大きな利点となります（図8）。

The PureLink Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo Kit shows greater total DNA yields than the Invitrogen S.N.A.P. Gel Purification Kit, even for larger fragment sizes.

図 8.PureLink Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo Kitでは、非常に大きい断片サイズにおいても、Invitrogen™ S.N.A.P.™ Gel Purification Kitより高い全DNA収量が得られます。Platinum SuperFi 2X Green Master Mixを用いて、さまざまなサイズのλDNAから増幅したPCR産物をゲル精製しました。PureLinkキット（TOPO XL-2キット付属）とS.N.A.P. キット（TOPO XLキット付属）について、各DNA断片サイズで同じ出発材料を使用し、ゲル精製の比較を行いました。精製プロトコールは、マニュアルの記載に従いました。全DNA収量を定量し、比較しました。グラフから、PureLinkキットで得られた収量は、S.N.A.P.キットで得られた収量より増加していることがわかります。

形質転換効率を向上させるコンピテントセル

OmniMAX™ 2 T1^Rコンピテントセルは、Invitrogen™ One Shot™フォーマットにおいて、あらゆるケミカルコンピテントE. coli細胞で最高の形質転換効率（> 5 x 10⁹ 形質転換体/µg pUC19）を提供します（図9）。OmniMAX 2 T1^R細胞はE. coli K12株の制限システム（mcrA Δ(mrr hsdRMS mcrBC））を欠失しているため、汎用性が高く、高度にメチル化されたDNAについても効率的な形質転換を提供します。また、この菌株は、T1およびT5ファージ感染に対する耐性を与えるtonA 遺伝子型を有します。これにより、サンプルは保護され、実験室でのファージのコンタミネーションによるダウンタイムの可能性が最小限に抑えられます。

The chemically competent OmniMAX™ 2 T1R cells yield higher numbers of colony forming units (cfu) than TOP10 cells, following transformation of cloned DNA fragments.

図 9.クローニングされたDNA断片からの形質転換で得られたコロニー形成単位（cfu）は、ケミカルコンピテントOmniMAX™ 2 T1^R 細胞がTOP10細胞よりも高い値を示します。カナマイシンを含む選択培地をOmniMax 2 T1^R細胞およびTOP10細胞、1 mM IPTGを含む選択培地をOmniMAX 2 T1^R細胞に使用して、クローンを選択しました。10～12個の形質転換体をコロニーPCRで解析しました。

役立つヒント

OmniMAX 2 T1^R細胞を1 mM IPTGを添加した播種培地で培養すると、空ベクターを含む細胞に起因するバックグラウンドを低減でき、スクリーニングと選択を円滑に行えます。

高い染色感度

Invitrogen™ SYBR™ Safe DNA Gel Stainは、推奨されるゲル染色です。本製品は、青色光を利用することで、UV光曝露によるダメージを排除し、最高の感度を提供します（図10）。エチジウムブロマイド（EtBr）は現在も高感度な染色剤ですが、その際に使用されるUV光はDNAにニックを生じ、クローニング効率を低下させる可能性があります。クリスタルバイオレット染色では、白色光を利用しているためDNAにダメージを与えませんが、感度は低くなります。