GeneArt® CRISPR Nuclease mRNA

GeneArt® CRISPR Strings™ DNAは、CRISPR-Cas9システムの構成要素として、標的配列特異的に結合するguide RNA (gRNA) をエンコードするカスタムデザインされた二本鎖DNAフラグメントです。これらはU6またはT7プロモーター融合型で提供されます。U6プロモーターを含むCRISPR Strings™ DNAは、Ready-to-transfectのためCas9 mRNAと一緒に細胞に直接トランスフェクションすることができます。細胞内ではU6プロモーターがCRISPR gRNAの発現を制御し、共導入したCas9 mRNAから発現したCas9タンパク質との複合体が形成されます。T7プロモーターを含む CRISPR Strings™ DNAは、トランスフェクションの前に、当社のMEGAshortscript™ T7 Transcription Kitを使用してin vitro でgRNAを調製します。それから細胞へCas9 mRNAと共導入し、細胞内でCas9タンパク質との複合体が形成されます。トランスフェクション効率が低い細胞でのゲノム編集や、U6プロモーターがワークしない細胞においてプロモーターの制約が排除されるため、従来よりも幅広い細胞種でのゲノム編集が実現します。

CRISPR/Cas9システムを用いてゲノム編集を行うには、GeneArt® CRISPR mRNA のほか、GeneArt® CRISPR Strings™ DNAを別途購入いただくことが必要です。GeneArt® CRISPR Strings™ DNA order formをダウンロードしていただき必要事項を記入していただければ、標的遺伝子の配列からgRNAのデザインを弊社が行います。記入済みのオーダーフォームはjpgene@lifetech.comまでお送りください。

複数の細胞タイプにおけるCRISPR/Cas9によるゲノムDNA切断効率
切断効率はGeneArt® Genomic Cleavage Detection Kittによって検出を行いました。このキットは、CRISPR/Cas9によって切断された標的配列において、細胞のNHEJ修復機構の過程において生じる塩基の欠失や挿入(indels) をミスマッチ認識酵素が検出し、電気泳動で評価するアッセイ法に基づいています。

Figure 3. 様々な細胞タイプにおけるGeneArt® CRISPR Nuclease mRNAシステムによる効率的なゲノム編集ここに示す結果は異なるヒト細胞- (A) 293FT; (B) HCT116; (C) U2OS、を用いました。それぞれ24ウェルフォーマットでの培養細胞に対し、HPRTまたはRelA遺伝子を標的としてゲノム編集を行いました。細胞に導入したCRISPRの各フォーマットおよび標的遺伝子の情報は、それぞれの図の中に示します。従来のオールインワンベクターGeneArt® CRISPR Nuclease OFP vectorはLipofectamine® 3000 reagentでトランスフェクションされ、他のフォーマットについてはLipofectamine® MessengerMax reagentが 用いられました。トランスフェクション72時間後、細胞を回収し、GeneArt® Genomic Cleavage Detection Kitを用いてゲノム編集の効率について定量的に解析を行いました。CRISPRによって切断されたDNAは、電気泳動の画像中に矢印により示されます。

CRISPR/Cas9の2つのエレメントをともにRNAフォーマットで、かつLipofectamine® MessengerMax transfectionによってトランスフェクションすることで、幹細胞や従来トランスフェクション効率が低かった細胞での大幅なゲノム編集効率の改善がもたらされます。

効率的なマルチプレックスシステムが、よりシンプルなワークフローを提供します。1ウェルにおいて最大4ターゲットに対するゲノム編集を同時に行い、各ターゲットの切断効率を評価しました。Cas9 mRNAは複数のターゲットに対してデザインされたGeneArt® CRISPR Strings™ DNAとともにマルチプレックスゲノム編集に用いることができます。このアプローチによって、どのgRNAが標的配列に対して最も効果的にワークするか、あるいは異なるゲノム遺伝子座のゲノム編集を一度のトランスフェクションで行う、といったスクリーニングを実現できます。

Figure 6. GeneArt® CRISPR mRNA とGeneArt® U6 String DNAを用いたマルチプレックスゲノム編集。従来のオールインワンベクターGeneArt® CRISPR Nuclease reporter plasmid または、GeneArt® CRISPR Nuclease mRNA + U6 gRNA stringで同じターゲットに対してのゲノム編集効率を比較評価しました。またGeneArt® CRISPR Nuclease mRNAとU6 gRNA stringの組み合わせにより、同時にHPRT、AAVS1、EMX1遺伝子のうち2または3の複数ゲノム編集に対する効率を評価しました。実験は293細胞で行われました。

Cas9 mRNAはトランスジェニックモデル動物の作製アプリケーションにも有用。胚へのGeneArt® CRISPR nuclease mRNAのマイクロインジェクションやそのほかのin vivo実験のデータはまだ示されていませんが、一般的に多くの論文においてマウスやゼブラフィッシュ、Drosophilaといった幅広い生物種においてin vivoでのゲノム編集の成功例が報告されています。

Figure 7. Cas9 mRNAとin vitro転写gRNAを用いて高効率なマルチプレックスゲノム編集を実現。 オールインワンベクターまたは、GeneArt® CRISPR Nuclease mRNA + U6 gRNA stringの組み合わせを用いて、同時に1～3ターゲットのゲノム編集に対する効率を評価しました。またすべての実験サンプルにおいて、RelA特異的な切断が行われていることを確認しました（data not shown）。