GeneArt CRISPR Nuclease Vectors

GeneArt® CRISPR Nuclease Vector Kitはレポーターベクターシステムで、CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集に必要な機能的因子を発現します。このキットは、Cas9エンドヌクレアーゼも発現するプラスミドベクターを使ってnon-coding guide RNA (crRNAとtracrRNAを含む) の発現に必要なコンストラクトを構築します。

GeneArt® CRISPR Nuclease Vectors with OFP（橙色蛍光タンパク質）は、crRNAを発現する細胞集団をフローサイトメトリーでソーティングできます。GeneArt® CRISPR Nuclease Vectors with CD4は、crRNAを発現する細胞をビーズで濃縮することが可能です。

GeneArt® CRISPR Nuclease Vectors.(A) GeneArt® CRISPR Nuclease: OFPレポータープラスミドマップおよびGeneArt® CRISPR Nucleaseの特長： OFPレポーター 図のように、ベクターはヌクレオチド6,732 bpと6,752 bp間でリニアライズされ、各鎖の5’末端が5 bp塩基突出した形で提供されます。 (B) GeneArt® CRISPR Nuclease: CD4濃縮プラスミドマップおよびGeneArt® CRISPR Nucleaseの特長： CD4の濃縮 図のように、ベクターはヌクレオチド7,336 bpと7,355 bp間で線状化され、各鎖の5’末端が5 bp塩基突出した形で提供されます。 GeneArt® CRISPR Nuclease Vectorはいずれもリニアライズされており、Cas9ヌクレアーゼがターゲット配列を特異的にターゲッティングする発現カセットに目的とするターゲット配列が組み込まれたcrRNAをコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを迅速で効率的ににクローニングすることが可能です。

いずれかのGeneArt® CRISPR Nuclease Vector Kitを使用するためには、まずお客様で2種類の1本鎖DNAオリゴヌクレオチドをデザインしていただきます。1本はターゲット配列特異的なcrRNA (forward鎖のオリゴヌクレオチド)、もう1本は相補鎖(reverse 鎖のオリゴヌクレオチド) をそれぞれコードします。この相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングするだけで、キットに付属しているリニアライズベクターにクローニングするのに適した二本鎖オリゴヌクレオチドをお客様が作製することができます。

1本鎖オリゴヌクレオチドのデザインは、クローニングの成功とゲノム編集ツールとしてのコンストラクトの有効性の点で重要です。以下に示す総合ガイドラインは、ターゲット配列の選択と、1本鎖オリゴヌクレオチドをデザインするのに役立ちます。

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デザイン戦略およびターゲット配列の特異性

GeneArt® CRISPR Nuclease Vector Kitを使用するためには、まずお客様で2種類の1本鎖DNAオリゴヌクレオチド（24～25 bp）をデザインしていただきます。1本はターゲット配列特異的なcrRNA (forward鎖のオリゴヌクレオチド)、もう1本は相補鎖(reverse 鎖のオリゴヌクレオチド) をそれぞれコードします。ゲノム上のターゲット配列の選択は、DNAの切断効率を著しく左右します。そのため目的遺伝子座当たり少なくとも1つ以上のターゲット配列特異的なcrRNA配列をテストすることをおすすめします。以下に示すガイドラインを、ターゲット配列の選択を図で例示しながら説明します。またガイドラインは一般的なもので、例外も発生します。

• 長さ — ターゲット配列の3'末端がNGGからなるproto-spacer adjacent motif（PAM） 配列に隣接した19 塩基または20 塩基の長さの配列を選びます。U6 Pol IIIプロモーターから転写を開始するのに必要な5´Gは、既にベクターが5塩基突出した形で組み込まれていますので、ターゲット配列に組み入れる必要はありません。
  
• 相同性領域の確認 — オフターゲット効果を増大させることがあるため、ターゲット配列が他の遺伝子と顕著な相同性がないことを確かめてください。最近の報告では、gRNA-Cas9複合体がそれらのgRNAの部位によっては1～3またはそれ以上のミスマッチに耐えうる可能性があることが示されています。ターゲット配列の選択についてもっとお知りになりたい場合は文献をご参照ください。
  
• 方向性 — ターゲット遺伝子座のセンス鎖をコードするターゲット配列あるいはアンチセンス鎖をコードするターゲット配列のどちらを選んでもかまいません。したがって、3' 末端にPAM配列があることを満たしていれば、2つの方向性でCRISPR RNAを作製できます。

3.培養細胞へのCRISPRプラスミドのトランスフェクション　　

遺伝子導入方法

トランスフェクションの方法は、扱う細胞のタイプによって異なります。トランスフェクションを最適な方法で行うために、オリジナルの参照資料や細胞株の提供元の情報を調べてください。継代のタイミング、継代時の希釈率などにも注意してください。広範囲な哺乳類細胞株に高効率にトランスフェクションするには、カチオン性脂質をベースにしたLipofectamine® 3000 Reagentを使用することをおすすめします。

DNA精製度

真核細胞におけるトランスフェクション用プラスミドDNAはフェノールや塩化ナトリウムのコンタミのない純度の高いものを使用してください。トランスフェクションには、PureLink® HiPure Plasmid Midiprep Kitで調製した高品質のDNAを使用することをおすすめします。またプラスミドDNAは-20℃で保存してください。

DNA量

最高のトランスフェクション効率が得られるDNA量は、トランスフェクション試薬や細胞株によって異なります。最適なトランスフェクション条件を調べるには用量反応試験を行うことをおすすめします。当社の実績では、293FT細胞を用いて6ウェルフォーマット、CRISPR-Cas9発現プラスミド 3 μg、培養密度70%のときに最適なトランスフェクション効率が得られました。

CRISPR-Cas9システムによる切断効率

切断効率はGeneArt® Genomic Cleavage Detection Assayによって検出することができます。このキットは、CRISPR-Cas9によって切断されたターゲット配列において、細胞のNHEJ修復機構の過程において生じる塩基の欠失や挿入(indels) をミスマッチ認識酵素エンドヌクレアーゼが検出し、電気泳動で評価するアッセイ法に基づいています。

CRISPR-Cas9システムによる切断効率 HPRT遺伝子座をターゲットとしたDNA切断効率をGeneArt® Genomic Cleavage Detection Assayを用いて電気泳動による分析を行いました。 (A) HPRTに特異的なCRISPR RNAをを発現するGeneArt^® CRISPR Nuclease OFP Vectorを用いた結果を示します。 (B) HPRTに特異的なCRISPR RNAをを発現するGeneArt^® CRISPR Nuclease CD4 Vectorを用いた結果を示します。 HeLa細胞へのトランスフェクション後、切断効率の評価を3度独立して行い、indel (塩基の欠失と挿入) の割合を図中に示しました。

フローサイトメトリーによるトランスフェクション効率の測定

Cas9ヌクレアーゼはOFPまたはCD4遺伝子と共発現するため、トランスフェクション効率は蛍光顕微鏡またはフローサイトメーターで測定することができます。

トランスフェクション効率 (A)  RelA遺伝子座に特異的なcrRNAをコードするGeneArt® CRISPR Nuclease OFP Vectorを使用し、293T細胞へのトランスフェクション効率を評価しました。 トランスフェクションしたサンプル中のOFP陽性細胞の割合は90%以上であることが示されました。 (B) GeneArt® CRISPR Nuclease CD4 VectorにおけるCD4の機能性 AAVS-1遺伝子座をターゲットとしてデザインされたGeneArt® CRISPR Nuclease CD4 Vectorを使用し、293T細胞へのトランスフェクション効率を評価しました。 FITC標識抗CD4抗体によって細胞を染色し、フローサイトメトリ―によって解析しました。 染色された細胞集団は蛍光顕微鏡での観察も行い結果を示します。

Cas9およびgRNAを発現する細胞はCD4遺伝子の発現をレポーターとし、磁気ビーズであるDynabeads® CD4 magnetic beadsを用いて濃縮することができます。

Q. ゲノム編集におけるターゲット配列への特異性という面でCRISPR-Cas9システムとTALENsの違いはあるでしょうか。
A. 一般的にTALENsのほうがCRISPRsより高い特異性をもって切断を行うと考えられていますが、CRISPRのターゲット配列のデザインを注意して行うことで、低いオフターゲット効果を得ることもできます。Carefully designing the CRISPR target typically results in lower off-target effects.ターゲット遺伝子座の切断効率の評価についてはCRISPRs、TALENいずれの場合でもGeneArt® Genomic Cleavage Detection Kitを用いることで簡便に行うことができます。

Q. ターゲッティング効率にそれほど影響がない場合、どのようにしてNHEJ修復機構によって生じるオフターゲットを回避することができますか？
A. オフターゲットのリスクを最小化するには、BLAST検索によってターゲット遺伝子座以外の対象生物のゲノム中に、CRISPRターゲット配列の3’末端と14bp以上の相同性のある配列が存在しないことを確認することを推奨します。BLAST search the genome to make sure that no more than 14 bp of sequence identical to the 3' of CRISPR target sequence are present in genome, other than at the target locus.技術製品広報をダウンロードして詳しいCRISPR配列デザイン手順をご確認ください。

Q. 同じベクターコンストラクトで一度に異なる複数の遺伝子をターゲットすることができますか？
A. ベクターは1つで1ターゲットのみに使用することができます。異なる遺伝子座をターゲットとした2つのベクターを共導入することはできます。

Q. ターゲット部位をデザインするための何かツールはありますか？
A. はい、ございます。技術資料をダウンロードして詳しいCRISPR配列デザイン手順をご確認ください。

Q. TALsを使用する前にCRISPRをスクリーニングツールとして推奨する理由を詳しく説明してください。
A. ターゲット部位における切断効率の高さは、ターゲットとした遺伝子座へ正確にアクセスすること、クロマチンの状態、配列に依存するため、当社では1遺伝子に対して2つ以上の配列をデザインしてテストすることを推奨しております。CRISPR-Cas9システムによるゲノム編集の場合、ターゲット部位となる配列は19-20塩基ですので、お客様は各ターゲット部位に対してこれらの塩基を変更するだけです。GeneArt® CRISPR systemによって切断効率が最も高いターゲットとして最適な配列がスクリーニングされた後は、より高い精度をもった（オフターゲットリスクの低い）GeneArt® TALsを用いて生物学的関連性のある変異体をつくることをお勧めします。

Q. indel % はどのように計算しますか？
A. 計算式は以下の通りです：% Indel = 1 – ((1 – fraction cleaved) 1/2)

Q. CRISPRを用いて細胞株をカスタマイズするサービスを行っていますか？ 　
A. はい。当社ではカスタマイズサービスを行っております。

Q. GeneArt® CRISPR Nuclease Vectorにコードされているレポーター遺伝子としてOFPとCD4のメリット/デメリットをそれぞれ教えてください。
A. フローサイトメトリーベースの細胞ソーティングには、OFP (orange fluorescent protein) を利用できます。CD4については、フローサイトメトリーはもちろんのこと、抗CD4抗体コートの磁気ビーズによってマニュアルで細胞濃縮することもできます。詳しい情報についてはuser manualをご参照ください。

Q.ターゲットに合わせてCRISPRベクターのデザインとクローニングをカスタマイズするサービスもしていますか？
A. はい。当社にはCRISPRベクターをカスタマイズするサービスオプションもございます。

GeneArt® CRISPR Nuclease All-in-One Vector Kits

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