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リアルタイムPCR ー 定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR ）ー は非常に強力で高感度の遺伝子解析方法で、定量的遺伝子発現解析、ジェノタイピング、 SNP解析、病原体検出、創薬ターゲット検証、およびRNA干渉の測定を含む幅広いアプリケーションに使用されています。リアルタイムPCRで、細胞や組織内のメッセンジャーRNA(mRNA)およびマイクロRNA (miRNA)の定量をするときには、逆転写反応と組み合わせて実施します。
名前が示す通り、リアルタイムPCRは、PCR増幅が起こるそのタイミングから核酸の定量を行います。これはDNAおよびRNAのPCRベースの定量化におけるアプローチ方法を大きく変えるものです。PCRでは、反応終了後の産物量から、核酸の初期濃度を求めます。
デジタル PCR は核酸の検出と定量に対する新しいアプローチ方法です。この方法では内部標準や内因性コントロールに頼らず、標的分子数を直接カウントするので、従来のリアルタイム定量PCRに代わって絶対定量や希少対立遺伝子検出を行うことができます。
| デジタル PCR | リアルタイム PCR | PCR | |
|---|---|---|---|
| 概要 | PCR増幅が陰性のウェル分画を測定し、絶対コピー数を決定します。 | PCR増幅が起こるそのタイミングから核酸の定量を行います。 | PCRサイクルの終了後、蓄積されたPCR産物の量を測定します。 |
| 定量的ですか？ | はい、PCR反応が陰性のウェル分画の割合は、ポアソン統計的アルゴリズムに適合しています。 | はい、 PCRの指数増幅（対数）期に収集されたデータでは、PC R産物量が鋳型核酸量に正比例するからです。 | いいえ、ただし、ゲル上の増幅産物のバンドの濃さと既知濃度の標準産物のバンドとの比較により、「半定量的」な結果が得られます。 |
| アプリケーション |
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| 以下のDNA増幅：
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| サマリー | デジタルPCRの利点：
| リアルタイムPCRの利点：
| PCRの短所：
|
従来のPCRが限定的な理由を理解するには、 PCR反応中に何が起きるかを理解することが重要です。基本的なPCRランは、次の3つのフェーズに分割可能：
指数関数的増幅領域
PCR産物はサイクル毎に2倍ずつ増幅します(反応効率を100%と仮定)。反応は非常に特異的かつ正確に進みます。反応試薬が最適な条件で揃っているので、増幅産物はほぼ2倍ずつ、指数関数的に増幅します。
一次関数的増幅領域 （高い可変性）
反応が進行し、PCR産物が増幅するにつれて、試薬は徐々に消費されていきます。反応が減速し始めると、 PCR産物は各サイクルにおいて倍増しなくなります。
プラトー (エンドポイント: 従来の方法のゲル検出)
反応が停止すると産物はそれ以上増えません。さらに長時間放置すると、 PCR産物は分解し始めます。サンプル毎に反応速度が異なるため、各チューブや反応系におけるプラトーに達するポイントは異なります。これらの差はプラトー領域に現れます。従来のPCRではプラトー領域で測定を行います。エンドポイント検出ともいいます。
図1: PCR 期。
図2では、DNAの初期量が同じ3反復の反応系を比較した時に、プラトー領域でのPCR産物量が異なっていることが示されています（反応速度がチューブ毎に異なることが要因）。全ての反復サンプルが指数関数的に増幅している領域で測定を行うとより正確になります。
図 2: 同一のサンプルでも、 PCRのプラトー領域でのPCRサンブル量は異なります。
リアルタイムPCRは、定量を行うための非常に正確なデータをもたらす指数関数的増幅領域に焦点を当てています。指数関数的増幅領域において、リアルタイムPCR機器は、2つの値を算出します。まず反応系中の蛍光強度がバックグランドよりも有意に強くなったと判断できる蛍光値を算出します。これをThreshold Lineとします。次に各サンプル毎の蛍光値がThreshold Lineに達するPCRサイクル数を算出します。これをThreshold CycleまたはCtとします。Ct値を用いて、定量解析や、陽性・陰性の判定等を行います。未知濃度のサンプルのCt値を、標準サンプルと比較することにより、未知サンプル中の鋳型DNAの量が正確に測定できます。
図 3: 反応系中の蛍光強度がバックグランドよりも有意に強くなったと判断できる蛍光値に達するPCRサイクル数をThreshold CycleまたはCtといいます。
デジタル PCR では、はじめにリアルタイムPCRの反応液を非常に多くのウェルに分画します。この結果、ターゲット分子を含むウェル（陽性）と、含まないウェル（陰性）に分かれます。PCR反応終了後、陰性と判定されたウェル数を基にして、サンプル中のターゲット分子の絶対値を算出します。その際に標準や内因性コントロールを必要としません。
図 4: デジタルPCRは、陽性（黒）PCR反応と陰性（白） 反応の比率から、ターゲット分子の数をカウントします。
すべてのリアルタイムPCR反応では、PCR産物の増幅量をモニタリングするために、蛍光レポーター分子 ー 例えば TaqMan®プローブまたはSYBR® Green色素 ー が反応液に加えられています。標的アンプリコンの量が増えるにつれ、蛍光色素分子から発せられる蛍光量が増加します。
図 5: リアルタイムPCRの利点と従来のPCRの利点の比較。
Applied Biosystemsは、遺伝子発現、miRNA、コピー数田方およびSNPジェノタイピング解析を行うためのデザイン済みの遺伝子特異的なプライマー・プローブセットから、日常的にご利用になる試薬やプラスティック消耗品、および装置システムやソフトウェアなど、リアルタイムPCRのための一連の製品を包括的に提供しています。
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