リアルタイムPCRの TaqMan® Chemistry と SYBR® Chemistry の比較

バックグランド

最初は、インターカレーター色素をリアルタイムPCR産物の測定に使用しました。これらの色素の主な欠点は、特異的および非特異的なPCR産物の両方の増幅を検出することです。

TaqMan® ケミストリーの開発

PCRのリアルタイムシステムは、TaqDNAポリメラーゼの5 'ヌクレアーゼ活性を使用した蛍光標識プローブの導入により改善されました。これらの蛍光プローブが利用できるようになったことにより、特異的な増幅産物のみを検出するためのリアルタイム法の開発が可能になりました。

ステップバイステップ・プロセス

２種類のTaqMan® プローブ

２種類のTaqMan® プローブがあります:

• TaqMan® プローブ (クエンチャー色素としてのTAMRA™ 色素付き)
• TaqMan® MGB プローブ

対立遺伝子識別アッセイに推奨されるTaqMan® MGB プローブ

特に、従来のTaqMan® プローブが30塩基を超える場合は、対立遺伝子識別アッセイにTaqMan® MGB プローブを使用することをお勧めします。TaqMan® MGB プローブの構成:

• 3 '末端の非蛍光クエンチャー - クエンチャーは蛍光を発しないため、リアルタイムPCR機器はレポーター色素の蓄積量をより正確に測定することができます
• 3 '末端のMGB ― MGBはプローブの融解温度（Tm）を上昇させ、より短いプローブの設計を可能にします

その結果、TaqMan® MGBプローブは、適合プローブと非適合プローブの間で大きく異なるTm値を示し、より正確な対立遺伝子識別ができます。

TaqMan® ケミストリーの利点

• 蛍光シグナルの生成に、プローブとターゲット間の特異的ハイブリダイゼーションが必要
• プローブは異なる識別可能なレポーター色素で標識可能で、1つの反応チューブ中で2つの異なる配列の増幅および検出が可能
• PCR後の処理が不要となり、アッセイの操作や材料コストを削減

TaqMan® ケミストリーの欠点

主な欠点は、異なる配列には異なるプローブの合成が必要なことです。

バックグラウンド

二本鎖DNAに結合する小分子は、2つに分類できます：

• インターカレーター
• MGB (Minor-groove binders)

結合方法にかかわらず、リアルタイムPCRの検出用のDNA結合色素には2つの条件があります：

• 二本鎖DNAへの結合時に蛍光の増加
• PCRを阻害しない

PCRの阻害がほどんどなく、エチジウムブロマイドに比べて検出感度が高いSYBR® Green I 色素をPCRに使用できるよう開発しました。　また、従来のSYBR® Green Iより明るい蛍光を発し、PCRの阻害が少ないnewer SYBR® Green色素があります。

SYBR® 色素ケミストリーのしくみ

SYBR® 色素は、PCR中に形成される二本鎖DNAに結合することにより、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物を検出します。反応の仕組み

ステップバイステップ・プロセス

1. SYBR® 色素をサンプルに添加すると、すぐにサンプル内に存在する全ての二本鎖DNAに結合します。
2. PCRの間、 DNAポリメラーゼは PCR産物となるターゲット配列を増幅します。
3. その後、SYBR®色素は二本鎖DNAの新しい各コピーに結合します。
4. PCRが進むにつれ、より多くのPCR産物が生成されます。SYBR®色素は全ての二本鎖DNAに結合するので、その結果、増幅されるPCR産物の量に比例して蛍光強度が増します。

SYBR® 色素の利点

• あらゆる二本鎖DNAシーケンスの増幅のモニターに使用可能です。
• お客様のPCRプライマーが適切に設計され、反応系の特異性が十分に確保できていると考えられるケースでは、プローブは不要で、アッセイのセットアップとランニングコストを削減できます。

SYBR® 色素の欠点

主な欠点は、偽陽性シグナルを検出する可能性があることです； つまり、SYBR® 色素はどの二本鎖DNAにも結合するので、非特異的な二本鎖DNAシーケンスにも結合する可能性があります。従って、ターゲットでない配列を増幅することなく、またその融解曲線を解析するよう適切に設計したプライマーを用意することが非常に重要です。

さらなる考察

DNA結合色素の使用における他の考慮のポイントは、複数の色素分子が単一の増幅DNA分子に結合できるということです。複数個所に色素が結合するので、反応で増幅した二本鎖DNAの質量に依存して蛍光シグナル値は変動します。例えば増幅効率が同じ場合、短い産物よりも長い産物のほうが、より強いシグナル値を発します。これは蛍光プローブの使用とは対照的です。蛍光プローブではその長さに関わらず、合成された各増幅分子毎に、1個のリポーター蛍光分子がクエンチングから解放されて発光します。