代謝標識戦略

放射性類似体は、主に細胞や生物体の代謝標識の用途に一般的に使用される化合物です。放射性標識の同位体は化学構造を変化させることなく、生体分子モノマーで置換できるため、容易にin vivoへ組み込むことが可能です。また放射性巨大分子は、液体シンチレーション計数や陽電子放射断層撮影(PET)スキャンといった、高感度な放射分析装置で容易に検出ができます。放射性のトレーサーやアプリケーションの例：細胞増殖アッセイにおける3Hチミジンの取り込み；タンパク質合成測定における35Sメチオニンの標識；in vivoキナーゼアッセイにおける32Pオルトリン酸の標識；細胞代謝率の測定における14C標識D-グルコースの取り込みなど。放射性同位体は検出がしやすく比較的安価である反面、安全上の問題、放射性廃棄物の発生、生物体に対する毒性、放射性崩壊による経時的シグナル損失といった欠点も伴います。

安定同位体標識法は、放射性代謝標識法とは対照的に、非放射性の生体分子モノマーの同位体類似体を使用します。放射性同位体と同様に、安定同位体は化学構造を一切変更せずに生体分子モノマーへ組み込むことが可能です。代謝標識用の一般的な安定同位体には、2H、15N、13C、18Oなどがあります。これらの同位体は放射性でないため、これらの重安定同位体は天然の軽同位体との質量差異により質量分析(MS)で検出が行われます。

細胞培養液中アミノ酸による安定同位体標識法(SILAC)は、安定同位体を用いた代謝標識法として最も一般的です。[1] この手法では、重アミノ酸または軽アミノ酸（13C6リジンや13C6アルギニンなど）を含有した特殊な増殖培養液中で細胞培養を行います。標識後に軽アミノ酸と重アミノ酸の両サンプルを組み合わせて、相対的なタンパク質発現または翻訳後修飾の差異についてMS測定を行います。この定量的プロテオミクス法は有効性が非常に高く、微量なタンパク質レベルの変化を検出する用途にとりわけ有用です。また一度のMS分析で、最大3種類の実験条件を多重測定できます。

光反応性アミノ酸は、代謝標識やin vivo架橋が行えるアミノ酸の化学的類似体です。[2] これらのアミノ酸に含まれる小さなジアジリン官能基は、通常のラボ環境下で安定状態ですが、長波長UV光(330～370 nm)で光活性化される可能性があります。ジアジリン基はUV活性化時に遊離して、反応性カルベン中間体を生成します。この中間体は、近接するアミノ酸側鎖やペプチド骨格に共有結合します。

光反応性アミノ酸の例として、タンパク質の代謝標識に使用できるPhoto-L-LeucineとPhoto-L-Methionineの2種類があります。タンパク質間相互作用の研究にこのアミノ酸を利用すれば、タンパク質架橋をタンパク質相互作用界面で行える利点があります。しかしこれらのアミノ酸は天然対応物と同一構造でないため、一般に光反応性アミノ酸は同位体類似体よりも取り込み率が低く、細胞や複合生物体の長期増殖にも耐性がありません。

生体直交標識試薬は代謝標識化合物であり、生物学的プロセスを妨害せずに化合物の官能基を化学反応させることが可能です。[3] 化合物の代謝標識の基盤として、アジド、アルキン、アルデヒド、ケトンなどの生体直交官能基が使用されてきました。放射性または安定同位体の類似体とは異なり、生体直交類似体は直接検出されませんが、化学選択的な連結反応を介して別の検出化合物や親和性化合物と反応します。

化学選択的な連結反応とは、アジドとアルキン間の銅触媒性のヒュスゲン環化付加反応であり、一般的にクリックケミストリーと呼ばれています。[4] アジドやアルキンは、いずれもサイズが小さいうえに生物学システムへの適合性があるため代謝標識の官能基として使用できます。しかし従来のクリックケミストリー反応では、生物体に対して強毒性の銅を触媒として使用しています。そのため代替え法として、比較的大きなシクロアルキンを用いた銅非含有のクリックプローブが開発されました。

また別の化学選択的なライゲーションとして、シュタウディンガー・ライゲーションがあります。これは、ホスフィン化合物とアジド生体直交プローブを反応させます。[5] クリックケミストリーのようにライゲーションは高特異的であり、生理的pHの水性環境で反応を実行できます。しかし従来のクリックケミストリー反応とは異なり、シュタウディンガー・ライゲーションは銅を用いずに反応性となります。これによりシュタウディンガー・ライゲーションの生体適合性は高いですが、触媒が欠如しているため反応速度はクリック反応より遅くなる傾向があります。

以下を筆頭に、代謝標識用の様々な生体直交プローブが開発されています：新生タンパク質を標識するアジドホモアラニン；核酸を標識する5エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)；膜タンパク質を標識するアジドパルミチン酸；糖タンパク質を標識するアジド糖など。アジド糖試薬は、代謝標識用の生体直交プローブとして最初に開発された試薬の一つです。アジド糖を組み入れられたN結合型グリカンは、検出やアフィニティー精製においてアルキン/ホスフィン誘導体化合物に化学選択的に標的させることが可能です[6]。

ライゲーションにはビオチン・蛍光色素・質量タグなどの多種多様な検出化合物や親和性化合物が利用できるため、生体直交標識法は生体分子の代謝標識法として非常に汎用性が高いです。

生体分子の代謝標識では、分子組成に基づいて分子全体へ標識が分布します。例えば13C6リジンで細胞を培養すると、実験中に合成された全てのリジン含有タンパク質が取り込まれ（標識され）ます。一般的な代謝標識ストラテジーは、天然モノマーの構造に同一もしくは極めて類似した化学的類似体を使用するため、取り込み対象の特定部位や添加標識の数を制御することは通常不可能です。しかしながら、代謝プローブを設計して、遺伝子改変された生物体または無細胞in vitro翻訳系と組み合わせて使用すれば、部位特異的な代謝標識が可能です。

一般に部位特異的な組み込み法では、遺伝コードに存在する重複性の終止コドンを有効に活用します。この終止コドンを使用して、特異的操作されたtRNAを用いたアミノ酸類似体の組み込みが行えます。[7] この手法は、部位特異的な組み込みが可能になるだけでなく、内因性の合成や修飾機構に耐性のない化学的類似体（ビオチンまたは蛍光色素で標識されたアミノ酸など）による標識も可能になります。またこの手法では、遺伝的修飾された発現タンパク質への代謝標識取り込みが制限されます。

1. Ong S. E. et al.(2002).Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, silac, as a simple and accurate approach to expression proteomics.Mol Cell Proteomics.1, 376-86.
2. Suchanek M., et al.(2005).Photo-leucine and photo-methionine allow identification of protein-protein interactions.Nat. Methods 2(4):261-267.
3. Prescher J.A. and Bertozzi, C.R.(2005).Chemistry in living systems.Nature Chem.Bio.1(1):13-21.
4. Kolb H.C., et al.(2001).Click chemistry: diverse chemical function from a few good reactions".Angewandte Chemie 40(11): 2004-21.
5. Agard N., et al.(2006).A comparative study of bioorthogonal reactions with azides.ACS Chemical Biology 1(10):644-648.
6. Saxon E. and Bertozzi, C. (2000).Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction.Science 287:2007-10.
7. Wang L.; et al.(2001).Expanding the genetic code of Escherichia coli.Science 292 (5516):498–500.