3D 전자 현미경 | 연속 블록 - 페이스 전자 현미경

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연속 블록 페이스 이미징이란 무엇입니까?

세포 및 조직의 복잡한 3D 아키텍처를 이해하는 것은 생물학적 구조-기능 관계의 조사를 위해 필수적입니다. 생물학자는 이런 이유로 물리적 단면, 광학 연속 이미징 등 3D 이미징 기술을 활용해 세포의 미세구조와 형태를 연구하고 있습니다. 하지만 기존의 조직절편기 방식은 개별 시료 단면의 생성과 이미징에 의존하므로 까다롭고 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 현대적인 방법을 사용하면 영상 품질을 높이면서 수동 단계와 아티펙트(artifact)를 줄이는 in-situ 조직절편법 기능을 수행할 수 있습니다.

주사 전자 현미경 검사(SEM)에서 수행되는 Serial block-face imaging(SBFI)은 세포 미세 구조의 고분해능 이미징에서 점점 더 많이 사용되고 있는 기법입니다. 이 장비를 사용하면 과학자들은 밀리미터 단위의 부피 시료를 나노미터 분해능으로 연구할 수 있습니다. Thermo Fisher Scientific은 다양한 large volume 분석 장비를 제공하여 과학자로 하여금 세포와 소기관이 질병이나 다양한 실험 방법에 어떻게 반응하는지를 관찰할 수 있도록 합니다. 극저온 전자 현미경과 결합한 large volume 분석으로 세포 미세 구조에서 분자 상호 작용 맥락을 직접 관찰할 수 있습니다.

3D 전자 현미경 검사

기존 현미경법은 고해상도 2D 이미징을 위한 유용한 도구이지만, 이 이미지는 3D 구조를 추정하기 위해 전문가의 해석이 필요하다는 단점이 있습니다. 예를 들어, 미세소관의 단일 횡단면이 단순한 원 또는 타원으로 나타날 수 있습니다. 사용자는 2D 이미지를 평가한 다음, 이것이 미세소관의 어느 부분을 나타내는지 결정해야 합니다. 현대적인 3D 전자 현미경을 사용하면 순차적 이미지의 스택을 통해 전체 부피를 캡쳐하고 시료의 진정한 3D 구조를 관찰할 수 있습니다.

3D 전자 현미경은 2D 방법으로는 불가능한 다양한 생물학적 응용분야 에 있어 매우 중요한 도구입니다. 이러한 응용분야의 예로는 connectomics, 뉴런 상호작용 연구 등이 있습니다. connectomics에서 뉴런의 세부 정보를 표시하기 위해 고분해능으로 이미지를 수집해야 하며, 충분한 뉴런 대 뉴런 연결이 캡쳐되도록 대량의 데이터를 수집해야 합니다.

또한 3D 전자 현미경은 정량적 평가에도 유용합니다. 예를 들어, 심장 조직의 미토콘드리아 존재는 심장 건강을 평가하는 데 사용됩니다. 3D EM으로 많은 개별 세포의 large volume 이미징이 가능하며, 그 다음 분석 소프트웨어를 사용하여 전체 데이터에서 선택적으로 미토콘드리아를 볼 수 있습니다.

마지막으로, 망막 세포에서의 리본 시냅스와 같은 희귀 이벤트를 찾는 실험을 3D EM을 통해 간소화할 수 있습니다. 왜냐하면 큰 부피의 조직을 자동으로 수집하고, 수집후 수동으로 검토할 수 있기 때문입니다.

The area fraction of mitochondria vs total tissue

전체 조직에 대한 미토콘드리아의 면적 비율은 심장이 필요로하는 에너지의 양을 나타내는 지표이며, 이를 통해 과학자들은 질병 상태를 평가할 수 있다.

연속 블록-페이스 전자 현미경은 어떻게 작동합니까?

연속 블록 페이스 이미징 동안 전자빔은 먼저 레진-포매된 조직 시료의 표면을 스캔하여 시료의 2D 이미지를 캡처하는데 사용됩니다.

이 상단 표면은 in-situ 조직절편기를 사용하여 순차적으로 제거될 수 있습니다. 각 절단면의 두께는 사용자가 정의하지만 일반적으로 15-20 µm 보다 큽니다. 이 절단면을 폐기하면 파편 수집 장치에 의해 수집됩니다.

그런 다음, SEM을 사용하여 새 표면의 이미지가 수집됩니다. 이 과정이 샘플 전체가 이미징될 때까지 반복됩니다. 총 샘플 높이는 수십 마이크로미터에서 수백 마이크로미터 또는 그 이상일 수 있습니다. 그런 다음, 연속적인 이미지 스택이 3D 렌더링 소프트웨어를 통해 처리됩니다.

관심 영역 국지화, 다중 영역 또는 다양한 이미징 검출기 등 샘플 요구 사항과 특정 사용자에 맞게 연속 블록 페이스 이미징 프로세스를 최적화하고 조정할 수 있습니다.

Schematic showing the basic layout used during serial block face electron microscopy.

연속 블록 페이스 전자 현미경 검사의 기본 레이아웃을 보여주는 도식.

Diamond knife and block face ready for SEM imaging.

SEM 내에서 촬영한 사진으로 SEM 이미징용 다이아몬드 칼(왼쪽)과 블록 면(가운데)을 보여줍니다.

Thermo Fisher Scientific의 연속 블록 페이스 이미징 솔루션

Thermo Scientific Volumescope 2 및 Apreo 2 SEM은 다중 에너지 디콘볼루션 주사 전자현미경(MED-SEM)과 in-situ 절단을 결합하여 우수한 Z 분해능을 가진 새로운 연속 블록-페이스 이미징 솔루션을 제공합니다. 이 장비는 자동화와 사용편의성으로 전문 지식 수준에 관계없이 생산성을 향상시키고 큰 부피 시료를 위한 등방성 분해능을 제공합니다.

지금까지, 연속 블록 페이스 이미징의 축(axial) 분해능은 챔버내 조직절편기를 사용해 물리적으로 절단할 수 있는 최소 절편 두께에 의해 제한되었습니다. 그러나, 다중 에너지 디콘볼루션 SEM을 통한 새로운 큰 부피 시료 분석 방법으로 이제 진정한 등방성 3D 분해능 이미징이 가능해졌습니다. 기계적, 광학적 절단을 결합하고, 물리적 절단 사이에 다양한 빔(beam) 에너지를 적용하여 시료의 다양한 층에서 데이터를 획득할 수 있습니다.

또한, 최적화된 검출기와 낮은 진공 작동으로 까다로운 레진-포매 시료에서도 고품질 이미징이 가능합니다. 고유한 획득 소프트웨어는 낮은 수준의 셋업 및 정렬에서부터 전체 영상 시리즈의 무인 획득에 이르기까지 다양한 자동화 기능을 제공합니다. 이것은 초기 셋업에서 최종 결과까지 완전한 워크플로우를 포함하며, large volume 분석, 광학 현미경 이미지 오버레이, 재구성, 시각화, 분할을 위한 소프트웨어 솔루션을 제공합니다.

리소스

동영상
문서

Mayo Clinic의 Salisbury 교수는 정상 및 질병 상태의 구조를 관찰하기 위한 연속 블록 페이스 이미징을 이용한 최근의 3D 검사 등 다양한 생물학적 문제에 대한 해답을 얻기 위해 45 년 이상의 현미경 검사 경험을 논의합니다.

Large Volume 분석으로 촬영한 쥐 망막 치수: 9.65 x 10 x 25µm, HiVac 모드에서 10nm 등방성 분해능, 1.18/1.78/2.27kV, 100pA, 1µs 머무름 시간, 250장 이미지

Large Volume 분석으로 촬영한 제브라피쉬 배아 헤드 치수: 350 x 350 x 82.9µm. 42 x 42nm LoVac 모드에서의 픽셀, 2kV, 100pA, 3µs 머무름 시간, 100nm에서 829장 이미지 Brown University, Robbert Creton 시료 제공

쥐의 뇌: 부피 85 x 85 x 123um, 2.7kV, 400pA, 2us 머무름 시간, LoVac에서 15nm x 15nm x40nm, 2133장 이미지. EPFL Lausanne, Grahame Knott 시료 제공 Thermo Scientific Amira 소프트웨어를 사용한 데이터 분할 및 시각화

작동법