Cas9 단백질

TrueCut Cas9 단백질 v2를 사용한 CRISPR 유전자 편집은 최대 90%의 기능적 knockout을 통해 인간 일차 T 세포에서 견고한 편집 효율을 달성하였습니다.

그림 1. TrueCut Cas9 단백질 v2 및 TrueGuide 합성 gRNA를 사용한 T-세포 수용체 knockout. 인간 일차 T 세포는 Neon Transfection System을 사용하여 T 세포 수용체 알파(TRAC) 또는 베타(TRBC) 영역에 대해 TrueCut Cas9 단백질 v2 및 TrueGuide 합성 gRNA로 transfection되었습니다. (A)GeneArt Cleavage Detection Assay 및 (B) Attune NxT 유세포 분석기를 사용한 % T 세포 수용체-음성(TCR^–) 세포 측정을 통해 편집 효율을 측정했습니다. 두 가지 방법 모두 knockout 효율이 TRAC의 경우 90%, TBC의 경우 80%를 초과했습니다.

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TrueCut Cas9 단백질 v2는 유전자 및 세포주 전반에서 일관된 성능을 제공합니다.

그림 2. 암 세포에서 강력한 편집 효율 제공. 3개의 유전자에 대한  TrueGuide 합성 gRNA와 negative control은 TrueCut Cas9 단백질 v2와 복합체를 이룹니다. RNP 복합체는 Lipofectamine CRISPRMAX Cas9 transfection 시약을 사용하여 A549, U2OS 또는 MDA-MB231 세포에 전달됩니다. Transfection 72시간 후 GeneArt Genomic Cleavage Detection Assay (GCD)또는 Ion Torrent 차세대 염기서열분석(NGS)을 사용하여 세포를 수확하고 분할 효율(indel%)을 테스트했습니다. 테스트된 모든 유전자와 세포 주에서 분할 효율이 높게 나타났습니다.

그림 3. 세포 유형 및 전달 방법 전반에서 일관된 CRISPR 편집 효율 제공. 부착 세포주(A549, HepG2), 부유 세포(THP1), 일차 면역 세포(일차 인간 T 세포)를 포함한 4개의 대표 세포 유형을 CRSPRMAX 시약 또는 Neon Transfection System을 통해 형질 주입했습니다. RNP 복합체는 TrueCut Cas9 단백질 v2 및 TrueGuide positive/negative control sgRNA로 구성됩니다. 테스트 된 모든 세포 유형 및 분석법에서 TrueCut Cas9 단백질 v2에 대한 편집 효율이 높게 나타났습니다.

TrueCut Cas9 단백질 v2는 경쟁사 Cas9 효소 대비 최대 2배 더 높은 유전자 편집 효율을 지속적으로 제공합니다.

그림 4. 다른 Cas9 효소와 Invitrogen Cas9 비교. TrueCut Cas9 단백질 v2 및 해당 TrueGuide 합성 gRNA를 사용하여 유전체 편집을 수행하였습니다. 복합체는 (A) A549 및 (B) MDA-MB231 세포 주에서 최적화된 transfection 프로토콜 및 Lipofectamine CRISPRMAX transfection 시약을 사용하여 전달되었습니다.  PRKCG-T1 및 CMPK1-T1 등의 까다로운 유전자 자리에서도 다른 공급 업체의 제품 및 프로토콜에 비해 Invitrogen 시스템에서 분할 효율이 일관되게 더 높았습니다.
 

TrueCut HiFi Cas9 단백질의 충실도(특이성 또는 타겟 이탈 효과 최소화) 및 편집 효율(타겟 적중 편집의 백분율)을 TrueCut Cas9 단백질 v2 및 경쟁사의 고충실도 Cas9와 비교하여 평가하였습니다.   TrueCut HiFi Cas9는 측정 가능한 타겟 이탈 편집을 줄여주는 우수한 성능을 입증했습니다.

문제가 있는 유전자 자리 및 문제가 없는 유전자 자리의 예를 포함한 자세한 데이터는 당사의 애플리케이션 노트를 참조하십시오.
 

그림 5. TrueCut HiFi Cas9 단백질은 인간 일차 T 세포에서 우수한 타겟 이탈 프로파일 입증. 21개의 gRNA를 Neon 형질 주입 시스템을 사용하여 야생형 TrueCut Cas9 단백질 v2, TrueCut HiFi Cas9 단백질 및 다른 공급업체의 HiFi Cas9로 형질 주입하였습니다. Target-enriched GUIDE-Seq(TEG-Seq), 즉 Ion Torrent-adapted NGS 분석법이 타겟 이탈 검출을 위해 사용되었습니다. (A) 빨간색 점은 100%로 정규화된 타겟 적중 이벤트입니다. 회색 점은 각 타겟 이탈 이벤트의 위험 확률을 나타내는 해당 타겟 이탈 대 타겟 적중 비율 대비 플롯팅된 타겟 이탈 이벤트입니다. (B) 막대는 타겟 이탈/타겟 적중 비율 레벨에 따른 타겟 이탈 편집 횟수 및 심각도를 나타냅니다. TrueCut Cas9 단백질 v2 및 경쟁사의 HiFi Cas9와 비교하여 TrueCut HiFi Cas9 단백질은 모든 심각도 레벨에서 타겟 이탈 효과를 훨씬 더 적게 생성하였습니다.

동일한 실험에서 TrueCut HiFi Cas9의 타겟 적중 편집 효율은 경쟁사의 고충실도 Cas9에서 관찰된 것과 동등하거나 그 이상의 결과를 달성했으며 타겟 이탈 효과를 훨씬 더 적게 생성합니다.

그림 6. TrueCut HiFi Cas9 단백질은 인간 일차 T 세포에서 >80%의 타겟 적중 편집 효율 유지. 타겟 이탈 편집 횟수가 가장 적은 11개 gRNA의 하위 집합을 사용하여 indel 및 상동성 지정 복구(homology-directed repairs, HDR)를 비롯한 T 세포의 타겟 적중 활성을 평가했습니다. Ion Torrent NGS 기반 목적 증폭 산물의 염기서열 분석이 스크리닝에 사용되었습니다. TrueCut Cas9 단백질 v2에 대해 100%로 표준화된 TrueCut HiFi Cas9 단백질은 indel 및 HDR에 대해 각각 84% 및 88% 편집 효율을 달성했습니다.

유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서, TrueCut HiFi Cas9는 off-target effect을 줄이고 wt-Cas9와 경쟁사의 high-fidelity Cas9 대비 off-target 편집과 off/on 비율이 더 낮았습니다. 이와 동시에 TrueCut HiFi Cas9 단백질은 테스트된 모든 gRNA를 통해 높은 타겟 적중 편집 활성을 유지했습니다.

그림 7. TrueCut HiFi Cas9 단백질은 iPSC에서 높은 타겟 적중 편집 효율을 유지하면서 우수한 타겟 이탈 프로파일 제공.(A) 막대 그래프는 타겟 이탈이 검출된 3개의 유전자에 대한 on/off-target RPM을 보여줍니다. TrueCut HiFi Cas9는 wt-Cas9와 경쟁사의 high-fidelity Cas9 대비 높은 정확도와 동등한 타겟 적중 효율을 달성하였습니다. (B) BCL11A 및 HBB1 모두에 대해 TrueCut HiFi Cas9 단백질이 달성한 성공적인 indel 및 HDR의 비율은 wild-type TrueCut Cas9 단백질 v2 및 경쟁사의 HiFi Cas9 모두에 필적했습니다.