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CRISPR-Cas9용 가이드 RNA |
CRISPR-Cas9 및 스크리닝 응용 분야를 위한 고품질 gRNA
유전자 knock out 또는 특정 돌연변이 knock in을 위해 CRISPR-Cas9 시스템 사용 시 고품질의 가이드 RNA(gRNA)의 설계, 생산 및 전달은 성공을 위한 매우 중요한 요소입니다. TrueCut Cas9 단백질과 함께 사용하기 위해 즉시 transfection 가능한 gRNA가 필요하거나 transfection이 어려운 세포 또는 primary 세포에 편집 도구를 전달하기 위해 Lentivirus를 활용해야 하는 경우 모두, 당사에서 지원할 수 있습니다. 당사의 gRNA 유전자 검색 도구를 사용하여 이러한 두 가지 형식 중 하나로 사전 설계된 gRNA를 검색하거나 계속해서 다른 선택을 위해 아래 당사의 선택 가이드를 사용할 수 있습니다.
기능적 유전체학 스크리닝의 경우 high-throuput의 배열 스크리닝 또는 경제적인 pooling 스크리닝을 위해 당사는 고급 gRNA 설계를 CRISPR 라이브러리에 통합했습니다.
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CRISPR gRNA 형식에 대한 선택 가이드
 TrueGuide 합성 gRNA |  LentiArray Lentiviral gRNA |  정확한 gRNA 합성 키트 | |
| 개요 |
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| 형식 | 안정성을 위해 화학적으로 변형된 합성 RNA 올리고 | Lentivirus 입자 | in-vitro에서 전사(IVT) gRNA |
| 응용 분야 | Knockout(사전 설계형) 또는 knock-in(맞춤형) | Knockout(라이브러리 스크리닝 포함) | Knockout 또는 knock-in |
| 종 |
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| 전달 방법 | Lipid-mediated transfection 혹은 electroporation | Lentivirus transduction | Lipid-mediated transfection 혹은 electroporation |
| 권장되는 Cas9 형태 | TrueCut Cas9 단백질 | LentiArray Cas9 Lentivirus | TrueCut Cas9 단백질 |
| Control | Positive/negative control 사용 가능 | Positive/negative control 사용 가능 | |
| 주문하기 | 주문하기 | 주문하기 |
gRNA 검색 및 주문을 위한 빠른 도구
사전 설계된 합성 또는 Lentivirus CRISPR sgRNA 검색
TrueGuide 합성 gRNA는 타겟 유전자의 특이성과 고효율 knockout을 제공하도록 설계된 즉시 형질 주입 가능한 CRISPR 단일 가이드 RNA(sgRNA)입니다. 편집된 세포를 농축하거나, transfetion이 어려운 세포로 작업하거나, 장기 sgRNA 발현이 필요한 경우 당사의 LentiArray CRISPR gRNA를 사용해 보십시오.
당사의 유전자 검색 도구를 사용하여 사전 설계된 TrueGuide gRNA를 검색해 보십시오.
당사의 선택 도구를 사용하여 사전 설계된 LentiArray CRISPR gRNA를 검색해 보십시오.
맞춤형 합성 gRNA 주문하기
직접 디자인을 하셨습니까? 저널 논문, 동료, 선호하는 설계 도구 등 출처가 어디이든 당사의 단순하고 빠른 인터페이스를 사용하여 맞춤형 TrueGuide gRNA로 합성하려는 맞춤형 gRNA 염기서열을 업로드하십시오.
당사의 설계 도구를 사용하여 유전자 편집 실험을 생성하고 gRNA를 주문하십시오.
엔지니어링 세포주 생성을 위한 설계 지원이 필요하십니까? 당사의 무료 TrueDesign Genome Editor 소프트웨어를 사용하여 CRISPR 유전자 knockout, knock-in 또는 태깅 실험을 설계할 수 있으며 이를 위한 일체의 시약(gRNA 포함) 세트를 주문할 수 있습니다.
플레이트 형식 가이드 RNA 또는 기타 특별 주문에 대해서는 당사에 문의하십시오.
96-well plate 전달용으로 24개가 넘는 gRNA를 주문하거나 다른 nuclase 또는 특정 scaffold 염기서열과 함께 사용하기 위해 gRNA를 주문하려는 경우 GEMservices@thermofisher.com으로 문의하십시오.
CRISPR용 TrueGuide 합성 gRNA
Invitrogen TrueGuide 합성 gRNA는 고효율 편집을 위해 독점 알고리즘으로 설계된 즉시 transfection 가능한 CRISPR 가이드 RNA입니다. 이러한 사전 설계 및 보장된 단일 가이드 RNA는 인간 및 생쥐 유전체에서 높은 특이성으로 타겟의 knockdown을 제공합니다.
TrueGuide 1-piece 변형 합성 gRNA | |
| 생쥐 및 인간 세포에 대해 사전 설계된 knockout | |
| 맞춤형 염기서열 | |
| 검증된 control 사용 가능 | |
| Plate 형식으로 제공 | |
| 즉시 transfection 가능 | |
| 화학적인 변형* | |
| 일차 세포와 줄기 세포에 이상적 |
* 화학적 변형에는 2´O-Methyl analog 및 phosphorothioate 연결이 포함되어 있어 편집 효율을 높이고 nuclease 분해로부터 보호됩니다.
데이터: TrueGuide 합성 gRNA를 사용한 고효율 편집
그림 1. Cas9-발현 ME-180 세포에서 TrueGuide 합성 gRNA를 사용한 강력한 kinase 유전자 분할. 평균 cleavage 효율은 >60%로 나타났습니다.
데이터: 세포 생존율을 유지하는 데 도움을 주는 TrueGuide 합성 gRNA
그림 2. 최적화된 프로토콜과 함께 제공되는 TrueGuide 합성 gRNA로 세포 독성 최소화. 당사의 권장 형질 주입 프로토콜을 사용하여 TrueCut Cas9 단백질 v2 및 타겟 특이적 TrueGuide 합성 gRNA를 두 개의 암 세포주에 복합체를 형성하고 제공하는 데 Lipofectamine CRISPRMAX가 사용되었습니다. 세 개의 유전자 자리 중 두 개(PRKCG-T1 및 CMPK1-T1)는 편집이 어려운 것으로 알려져 있습니다. 세포 생존율은 PrestoBlue를 사용하여 측정했습니다. 데이터에 따르면 형질 주입으로 인해 독성이 최소로 나타났으며 전체 세포 생존율은 100%에 가깝게 유지되었습니다.
TrueGuide 합성 가이드 RNA - 자주 묻는 질문(FAQ)
gRNA 또는 가이드 RNA는 CRISPR-Cas9 시스템의 일부입니다. gRNA 분자에는 타겟 특이적 CRISPR RNA(crRNA)와 보조 trans-activating crRNA(tracrRNA)의 두 가지 구성 요소가 있습니다. gRNA는 20-mer crRNA 염기서열과 타겟 유전체 염기서열 사이의 염기 결합을 통해 Cas9 단백질을 특정 유전자 자리로 유도합니다.
sgRNA는 single guide RNA를 의미하며, CRISPR RNA(crRNA)가 혼합되는 두 부분 구성 가이드를 사용하는 기존 S. pyogenes CRISPR-Cas9 시스템과 반대입니다. sgRNA는 두 RNA를 하나의 긴 RNA로 결합합니다. sgRNA는 일반적으로 길이가 100 nt이며 벡터에서 발현되거나 화학적으로 합성됩니다.
변형된 sgRNA는 두 부분으로 구성된 시스템보다 더 많은 세포 유형에서 높은 효율을 입증하였기 때문에, TrueGuide crRNA:tracrRNA 두 부분으로 구성된 가이드 RNA 제품 형식은 단종되었습니다. 이를 통해 당사는 합성 gRNA 제품을 단순화하고 변형된 sgRNA에 초점을 맞출 수 있었습니다.
CRISPR gRNA는 Thermo Fisher Scientific에서 화학적으로 합성된 RNA 올리고, 패키징된 Lentiviurs 입자로 제공되거나 GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit를 사용하여 in-vitro에서 전사(IVT) gRNA로 생성됩니다.
화학적 변형에는 분자의 5′ 및 3′ 말단에서 2’ O-Methyl analog 및 phosphorothioate internucleotide 간 연결이 포함됩니다. 이러한 변형은 각각 타겟 부위에 대한 결합을 증가시키고 nuclease 분해를 억제하여 편집 효율을 향상시킵니다.
맞춤형 gRNA 주문 도구를 사용하여 화학적 변형 없이 sgRNA를 구매할 수 있습니다.
TrueCut Cas9 단백질의 transfection 시 TrueGuide 합성 gRNA는 세포 독성 및 선천성 면역 반응을 최소화하면서 광범위한 세포 유형에서 편집 효율을 극대화합니다. 플라스미드 기반 시스템과 달리 RNP 시스템은 더 빠른 발현을 보이며, 무작위 통합과 off-target효과를 최소화합니다.
TrueGuide 합성 gRNA 염기서열은 염기서열의 무결성을 검증하기 위해 질량 분석법으로 분석됩니다.
Poolinh된 세포 모집단에서 CRISPR/Cas9 매개 편집 효율을 평가하기 위해 GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit, 차세대 염기서열 분석(NGS) 또는 sanger 염기서열 분석을 사용할 수 있습니다. 편집된 모집단에서 앰플리콘의 NGS 또는 플라스미드로 복제된 앰플리콘의 생어 염기서열 분석과 같은 염기서열 분석 방법 중 하나를 사용하면 편집 효율과 indel 유형에 대한 더 정확한 추정치를 얻을 수 있습니다. 이러한 방법에 대한 보다 자세한 설명과 프로토콜 지침은 각각 TALEN 및 CRISPR 검증 도구 페이지와 TrueGuide 합성 gRNA 사용자 안내서를 참조하십시오.
형질 주입이 어려운 세포주의 스크리닝 및 편집을 위한 LentiArray Lentivirus gRNA
Invitrogen LentiArray CRISPR gRNA는 효율적인 유전자 knockout을 위해 사전 설계 및 사전 패키징된 gRNA Lentivitus입니다. LentiArray CRISPR gRNA 설계는 독점 gRNA 설계 알고리즘으로 생성되었고 특이성을 저하 시키지 않으면서 knockout 효율을 극대화하는 데 최적화되어 있습니다.
LentiArray CRISPR gRNA는 LentiArray CRISPR 라이브러리를 사용하여 high-throuput 스크리닝 실험을 수행할 때 pre-screen assay 개발 및 스크리닝 후 HIT 검증을 지원하는 데 사용할 수 있습니다. LentiArray CRISPR gRNA는 Cas9 Lentivirus와 함께 사용하여 형질 주입이 어려운 세포주 및 일차 세포에서 유전체 편집 실험을 수행해야 합니다.
데이터: LentiArray gRNA로 EGFP의 성공적인 knockout
그림 3. LentiArray gRNA를 사용한 EGFP의 CRISPR-Cas9-매개 knockout.(A) A431 세포는 LentiArray Cas9 Lentivirus 및 LentiArray CRISPR gRNA를 사용하여 EGFR knockout(오른쪽 열)되었고, 처리되지 않은 세포(wild type 왼쪽 열) 및 gRNA 없이 Cas9만 처리된 세포(Cas9 control, 중간 열)와 비교하였습니다. EGFR 발현(녹색), 핵(파란색) 및 cytoskeletal F-actin(빨간색)으로 세포를 염색한 다음 면역 형광법을 통해 분석하였습니다. EGFR 발현 손실은 EGFR knockout 세포(c, f)에서만 관찰되었습니다. (B) EGFR 신호의 감소도 control 대비 EGFR knockout 세포 내 타겟 단백질의 western blotting을 통해 관찰되었습니다.
빠른 맞춤형 설계 생성을 위한 IVT gRNA
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit는 guidd RNA(gRNA)의 빠른 합성을 위한 완벽한 시스템입니다.
이 키트를 사용하면 타겟 염기서열에 대한 코드가 있는 2개의 짧은 단일 가닥 올리고가 시작 물질로 작동하며, gRNA 템플릿이 짧은 “한 용기 내(one-pot)” PCR 반응에서 T7 promoter를 사용하여 이 올리고에서 조립됩니다. 그런 다음 조립된 산물이 in-vitro transcription(IVT) 반응의 템플릿으로 사용됩니다. 후속 고속 정제 단계에서 4시간 내에 높은 수율(>10 µg)과 높은 농도(>200 ng/µL)로 transfection 준비가 된 gRNA가 생산됩니다.
IVT gRNA와 당사의 TrueCut Cas9 단백질 v2의 결합은 다양한 부유 및 부착 세포 주에서 테스트되어 >70%의 분할 효율 및 독성 징후가 없음을 보였습니다.
이러한 gRNA는 또한 즉시 transfection할 수 있는 당사의 CRISPR nuclease mRNA와 함께 동시 transfection이 가능합니다. 단백질 및 mRNA Cas9 형식 모두 플라스미드 조작이 필요하지 않으며 high-throuput 및 multiplex genome-wide 세포 엔지니어링 접근법과 호환됩니다.
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