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TALEN 및 CRISPR 검증 도구 |
유전자 편집 실험을 최적화 및 검증하기 위한 CRISPR 검증 방법
치료에 적용하기 위해 세포, 조직 또는 체내에서 특정 유전자 돌연변이를 생성할 수 있는 강력한 유전자 편집 시스템에 대한 약속은 유전자 편집 연구 분야의 원동력이 되고 있습니다.
TALEN 또는 CRISPR 실험 수행 여부와 관계없이 모든 유전체 편집 전략에는 예상되는 유전자 편집 결과의 정확도 및 신뢰도를 평가하고 비특이적 DNA 편집 위험을 줄이기 위한 검증 계획이 필요합니다. TALEN 및 CRISPR 검증은 세포 건강 상태 평가부터 타겟 발현에 이르는 유전자 편집 워크플로우의 다양한 단계에서 수행되어야 합니다.
워크플로우의 모든 단계에 대한 CRISPR 검증 기법
권장되는 검증 기법을 확인하려면 워크플로우 단계를 선택하십시오.
분할 검출, 염기서열 분석, 웨스턴 블로팅 및 PCR은 CRISPR 편집을 확인하는 효과적인 기법입니다.
고함량 스크리닝 및 세포 배양 연구를 사용하여 표현형을 검증할 수 있습니다. TEG-seq는 유전자 편집 후 생성될 수 있는 타겟 이탈 분할 이벤트를 측정하기 위해 개발된 세포 내 분석법입니다.
분할 검출, 염기서열 분석, 웨스턴 블로팅 및 PCR은 CRISPR 편집을 확인하는 효과적인 기법입니다.
고함량 스크리닝 및 세포 배양 연구를 사용하여 표현형을 검증할 수 있습니다. TEG-seq는 유전자 편집 후 생성될 수 있는 타겟 이탈 분할 이벤트를 측정하기 위해 개발된 세포 내 분석법입니다.
T7 endonuclease-based assay를 사용하여 TALEN 또는 CRISPR 편집을 검증하십시오.
Invitrogen GeneArt Genomic Cleavage Detection (GCD) Kit는 CRISPR 또는 TALEN 삽입, 삭제 또는 유전자 조절을 신속하고 신뢰성 있게 확인할 수 있도록 설계된 T7 endonuclease assay 입니다. 세포 수확부터 결과 정량화까지 수작업 시간이 최소화되어 유전체 편집 이벤트의 분석을 단 4시간 만에 수행할 수 있습니다.
데이터: Invitrogen GeneArt Genome Cleavage Detection Kit를 사용하여 CRISPR 분할의 효율을 측정하기 위한 세포 lysate의 gel analysis
그림 1. CRISPR-Cas9–mediated cleavage efficiecy HPRT 유전자 자리에 대해 Invitrogen GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit를 사용한 cleavage assay의 겔 영상. (A) HPRT 특이적 CRISPR RNA를 발현하는 GeneArt CRISPR Nuclease OFP Vector를 사용하여 얻은 결과. (B) HPRT 특이적 CRISPR RNA를 발현하는 GeneArt CRISPR Nuclease CD4 Vector를 사용하여 얻은 결과. HeLa 세포에 transfection 후 3회 반복으로 cleavage assay를 수행하고 결실(indel) 비율을 계산했습니다.
CRISPR 검증을 위한 positive/negative, delivery control
Positive/negative, delivery control을 적절하게 사용하는 것은 유전자 편집의 성공률을 좌우합니다. 초기 설계부터 모든 유전자 편집 작업의 검증까지 유전자 편집 실험을 설계할 때 Thermo Fisher Scientific에서 제공하는 CRISPR control 제품군을 참조하십시오.
TALEN 및 CRISPR 염기서열 분석을 통해 TALEN 및 CRISPR-Cas9 편집 효율 검증
GeneArt Genomic Cleavage Detection(GCD) assay는 빠르고 저렴하지만 원하는 돌연변이만 유입되었는지 확인하기 위해서는 결과를 추가로 분석해야 합니다. DNA 염기서열 분석으로 이를 수행할 수 있습니다.
Sanger 염기서열 분석을 이용한 TALEN 및 CRISPR 염기서열 분석
Sanger 염기서열 분석은 저렴한 비용의 표적 염기서열 분석, 간단한 워크플로우, 복잡하지 않은 데이터 분석 등의 이점이 있어 TALEN 및 CRISPR 실험에 중요한 검증 도구입니다.
데이터: Sanger 염기서열 분석을 이용한 CRISPR-Cas9 편집 효율 평가
Nuclease cleavage의 효율을 측정하는 데 sanger 염기서열 분석을 사용할 수 있습니다. 다음 실험에서 SeqScanner 2 소프트웨어를 사용하여 처리된 세포의 lysate을 염기서열 분석했습니다. 결과는 편집이 발생한 혼합 염기서열을 보여줍니다 (그림 2A). 그런 다음 Tracking of Indels by Decomposition(TIDE, Brinkman, EK 외 (2014)) 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석하였습니다. Thermo Fisher Connect의 SeqScreener 유전자 편집 확인 앱을 사용해 타겟 돌연변이의 스펙트럼 및 빈도를 측정할 수 있습니다.
그림 2. Sanger 염기서열 분석을 이용한 편집 효율 측정 (A) SeqScanner 2 소프트웨어를 사용하여 인간 HPRT 유전자 위치에서 유전체 편집 이벤트와 혼합된 HEK293 세포 집단을 분석했습니다. 적색 화살표로 표시된 편집 위치를 주목하십시오. (B) TIDE 소프트웨어를 사용한 염기서열 추적 분석. -1, -2, -3 등이 삭제될 것으로 예상되는 세포 내 위치과 전체 편집 예상 효율이 표시됩니다.
도움말: Nuclease 분할 효율을 측정하는 또 다른 방법은 처리된 세포에서 증폭 산물을 플라스미드로 subcloning하고, 각 bacteria subclone을 sanger 염기서열 분석하는 것입니다. 성공적으로 편집된 subclone의 수를 세면 편집 반응의 효율을 측정할 수 있을 뿐만 아니라 편집의 결과로 발생한 염기서열 유형을 시각화할 수 있습니다.
애플리케이션 노트 다운로드: Sanger 염기서열 분석을 사용한 CRISPR 및 TALEN 매개 유전체 편집 워크플로우차세대 염기서열 분석(NGS)을 사용한 TALEN 및 CRISPR 염기서열 분석 연구
NGS는 TALEN 및 CRISPR 분석을 위한 high-throuput 기능을 갖춘 강력한 도구를 제공합니다. 이 방법은 모든 TALEN 및 CRISPR 타겟 돌연변이의 정성적 및 정량적 스크리닝을 제공합니다. NGS는 한 번에 많은 시료를 분석하여 원하는 TALEN 또는 CRISPR 타겟 돌연변이가 있는 세포를 정확하게 판별할 수 있습니다. 또한 여러 시료에 대한 TALEN 및 CRISPR NGS 분석을 통해 타겟 이탈 효과를 평가할 수 있습니다.
TALEN 및 CRISPR 세포 배양 연구를 통해 세포의 건강 상태 및 표현형을 평가할 수 있습니다.
유전자 편집 워크플로우의 모든 단계는 생존 가능한 건강한 세포를 유지해야 합니다. 생존도, apoptosis 또는 스트레스 반응에 대한 검사는 일상적으로 수행해야 하며 효과적인 유전자 변형의 검증 뿐만 아니라 최적의 실험 조건을 판단하는 데에도 적절한 단계입니다.
형광단백질의 발현 및 항생제 내성은 형질 주입 효율 및 표적 발현을 측정하는 데 널리 사용되는 두 가지 기법입니다.
데이터: Immunochemistry을 사용한 Cas9 전달 검증
Immunochemistry은 세포 내 특정 단백질 식별을 위한 표준 기법입니다. Cas9 1차 항체 및 라벨링된 2차 항체를 사용하여 형광 영상화를 통해 세포 내 Cas9 발현을 개별적으로 검출할 수 있습니다.
그림 3. Cas9 전달 모니터링. (A) U2OS 세포 및 (B) U2OS-Cas 9 세포를 CRISPR-Cas9 단클론 항체로 처리한 다음, goat anti-mouse Alexa Fluor 594 conjugate 및 Hoechst 33342로 염색했습니다. 세포질 내 빨간색으로 염색되어 보이는 반점은 Cas9의 존재를 보여줍니다. 세포는 EVOS FL Auto Cell Imaging System을 사용하여 시각화하였습니다.
데이터: 자동 세포 계수, 투과광 이미징 및 유세포 분석을 사용한 CRISPR Cas9 Lentivirus 전달 검증
항생제 선별, 유전자 발현 및 Immunochemistry 분석은 세포의 유전자 편집을 위해 CRISPR 구성 성분을 모니터링하는 데 자주 사용됩니다. 형광 단백질 발현은 직접적으로 측정할 수 있으며 transfection된 세포 식별에 항생제 선별 사용 시 선택 과정 모니터링을 위해 생존도 검사를 사용할 수 있습니다.
그림 4. Countess II FL Automated Cell Counter를 사용하여 측정한 GFP 발현. Cas9 단백질을 발현하는 U2OS 세포가 1과 2의 MOI에서 Invitrogen LentiArray Positive Ctrl gRNA(HPRT-GFP) 및 Invitrogen LentiArray Negative Ctrl gRNA(Scrambled-GFP)를 사용하여 transduction되었습니다. 이틀 후 Countess II FL Automated Cell counter를 사용하여 세포 수 및 GFP 측정을 수행했습니다. 측정 결과로 GFP에 양성인 세포의 비율을 보여주며 GFP 및 puromycin 내성 유전자를 발현하는 transfection된 세포의 비율을 알 수 있습니다(2A 및 2B).
그림 5. 투과광 이미징을 위한 EVOS XL Core Imaging System을 사용한 항생제 선택. Invitrogen GeneArt Lentiviral CRISPR 양성 control 입자(HPRT-GFP)를 이용해 transfection된 세포는 정상적인 viabiilty를 보여줍니다. (A) 처리 전. Puromycin 선별 4일 후 (B), 세포는 항생제에 반응하여 스트레스 상태로 응집되어 있습니다.
그림 6. 유세포 분석을 사용한 293T 세포의 transfection 효율 측정. Invitrogen GeneArt CRISPR Nuclease Vector with OFP Reporter Kit은 transfection된 세포 라벨링에 주황색 형광 단백질(OFP)의 발현을 이용합니다. Transfection 효율은 293T 세포에서 Attune NxT 유세포 분석기를 사용하여 측정하였고 데이터는 transfection된 시료에서 >90% OFP 양성 세포를 보여줍니다.
CRISPR 분석을 위한 western blotting
Western blotting은 분석되는 시료에 특정 단백질이 있는지 검출하고 판단하기 위해 광범위하게 사용되는 기법입니다. CRISPR 실험에서 western blotting은 형질 주입 효율을 판단하고 발현을 측정하는데 사용됩니다.
데이터: Western blotting을 통한 CRISPR transfection 효율 및 단백질 발현 검증
그림 7에서 western blotting은 여러 CRISPR 형식으로 transfection된 세포에서 Cas9 발현을 비교하기 위해 사용되었습니다. 그림 8과 같이 western blotting을 사용하여 세포 모집단에서 표현형 변화를 정량화할 수도 있습니다.
그림 7. 플라스미드 DNA, mRNA 및 단백질 transfection된 세포에서 western blotting을 통한 시간 경과에 따른 Cas9 accumulation 검출. HEK293FT 세포에 Cas9 플라스미드 DNA, mRNA 또는 단백질을 사용하여 transfection했습니다. 지정된 시간에 세포를 수확하여 western blotting 분석을 수행했습니다. 세포 lysate로부터 얻은 단백질은 NuPAGE 4–12% Bis-Tris 겔에서 분리한 후, iBlot 2 Gel Transfer Device를 사용하여 PVDF membrane으로 이송하였고, 1:3,000 비율로 희석한 생쥐 단클론 Cas9 항체 및 1:2,000 비율의 토끼 항 생쥐 HRP conjugate 2차 항체 와 함께 배양하였습니다. 이 막은 Pierce ECL substrate을 사용하여 개발되었습니다. (Liang 외, Journal of Biotechnology, 208, 44–53.)
그림 8. Chloroquine 처리 후 CRISPR-편집 Hap1 세포에 LC3B가 응집됩니다. LC3B는 정량적 현미경 검사 또는 western blotting을 사용하여 측정할 수 있습니다.
TALEN 및 CRISPR 검증에서 중합효소 연쇄반응(PCR) 사용
TALEN 및 CRISPR 검증을 위해 겔 전기영동, 제한효소 처리, sanger 염기서열 분석 또는 NGS와 함께 타겟 영역의 PCR 증폭을 사용할 수 있습니다. 또한 실시간 PCR을 사용하여 세포의 유전자 발현 수준을 검증할 수 있습니다.
CRISPR 검증의 high-content screening(HCS)
High-content imaging 플랫폼은 단일 세포 분석 기능과 매우 빠른 데이터 처리 시간을 통해 탁월한 high-content screening(HCS)을 제공합니다. 이 자동화된 현미경 형광 이미징 및 분석 플랫폼은 단백질 발현, 구획화 및 세포 형태 변화에 대한 분석을 제공하며 모두 엄격한 정량화 기준을 따릅니다. HCS는 monolayer에서 스페로이드까지 정상, 고정 또는 활성 세포의 편향 없는 표현형을 제공합니다.
데이터: HCS를 사용한 CRISPR 편집 세포의 자가포식 분석
그림 9. HCS를 사용한 autophage의 자동 정량화. CRISPR-편집 HAP1 세포에서 LC3B 과립의 식별 및 세포 수 확인에 Thermo Scientific CellInsight CX7 플랫폼을 사용했습니다. 세포 라벨링에는 HCS NuclearMask Blue, HCS CellMask Deep Red 및 항 LC3B 항체 그리고 Alexa Fluor 647 염소 항 토끼 항체를 차례로 사용했습니다. Thermo Scientific HCS Studio 3.0을 사용한 자동 분석을 통해 세포 핵(파란색 오버레이), 세포 경계(초록색 윤곽선) 및 정량화된 LC3B 과립(형광 이미지와 막대 차트의 빨간색 오버레이)을 식별했습니다.
세포 신호 전달 경로를 조절하면 직/간접적으로 위험스런 결과가 나타날 수 있습니다. 타겟 단백질을 추적하고 세포 건강 및 거동의 다른 측면에 미치는 영향을 모니터링하는 것이 중요합니다. High-content screening(HCS)은 특히 이러한 유형의 다항목 검사에 적합하며 Invitrogen 시약은 세포 건강 및 거동 확인을 위한 다양한 도구를 제공합니다.
데이터: CRISPR 편집 세포의 apoptosis, 산화 스트레스, 단백질 분해 및 단백질 합성에 대한 HCS 분석
그림 10. Thermo Scientific CellInsight CX5 플랫폼을 사용한 다양한 세포 건강 파라미터의 신속한 분석.CellInsight CX5 HCS 플랫폼을 사용하여 야생형 및 CRISPR-편집 Hap-1 세포를 분석했습니다. 여기서 (A) apoptosis 분석에는 CellEvent Caspase-3/7 Green 검출 시약을 사용했고, (B) 산화 스트레스 분석에는 Invitrogen CellROX 시약을 사용했으며, (C) 단백질 분해는 Invitrogen LysoTracker 시약을, (D) 단백질 합성은 Invitrogen Click-iT OPP assay 키트를 사용했습니다.
맞춤형 TALEN 설계 및 검증에 대한 자세한 내용은 TALEN 설계에서 검증 서비스까지를 참조하십시오.
CRISPR 검증을 위한 리소스 및 지원
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