CRISPR knock-in 편집 및 유전자 태깅

그림 2. U2OS 세포 내 ACTB의 epitope tagging 인간 beta-actin 유전자의 C-말단 태깅을 위한 gRNA 및 adapter primer는  TrueDesign  Genome Editor와 TrueTag Donor DNA Kit, HA를 사용하여 준비한 Donor DNA로 설계되었습니다. Donor DNA는 puromycin 또는  blasticidin  selection marker를 포함한 C-3xHA donor DNA template을 사용하여 1단계 PCR로 준비되었습니다. 그 결과 PCR 산물(500 ng)은  Lipofectamine CRISPRMAX Cas9 transfection reagent을 사용하여  TrueCut Cas9 단백질 v2/gRNA(RNP) complex(500 ng Cas9/125 ng sgRNA)와 24-well plate의 2x10⁵ U2OS 세포와 함께 제공되었습니다. Transfection 후 48 시간 동안 세포를 1:4로 분할한 다음 0, 0.75 µg/ml 또는 1 µg/ml puromycin 또는 0, 8 µg/ml 또는 12 µg/m blasticidin으로 5 ~ 7일 간 처리하였습니다.   (A) 항생제 선택 후 세포의 부분 표본을 커버 슬립에 분주하고 4% 파라포름알데하이드로 고정하였으며 0.1% Triton X-100로 투명과정 후 HA 태그 단클론 항체(2-2.2.14)(DyLight 488)로 염색하였습니다.  Texas Red-X Phalloidin 및 NucBlue Live ReadyProbes 시약을 사용하여 세포의 세포 골격과 핵을 표식하였습니다. 그런 다음 Thermo Scientific CellInsight CX7 고함량 분석(HCA) 플랫폼을 사용하여 세포를 촬영하였습니다.  (B) 6-well plate에서 증식 후 protease inhibitor cocktail을 사용하여 보충된 약 100 µl의 Pierce IP Lysis buffer에서 세포를 수확하여 용해하였습니다.   NuPAGE 4–12% Bis-Tris protein gel을 사용하여 20 µl의 supernant 부분 표본을 분석하였습니다.  Untransfected cell lysate를 negative control로 사용했습니다.  분획 단백질은 iBlot 2 겔 전달 장치를 이용하여 nitrocellulose membrane으로 전달시켰습니다.  막은 30 ~ 60분 동안 차단하고 1:1,000 비율로 희석하여 HA Tag Monoclonal Antibody(2-2.2.14)로 하룻밤 동안 배양했습니다. 세척 후 막을 30 ~ 60분 동안 1:2,000 비율로 희석하여 HRP에 결합된 Goat anti-mouse 2차 항체와 함께 배양했습니다. 광범위한 세척 후 membrane을  SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate로 성장시킨 다음 iBright로 촬영하였습니다.  GAPDH에 대한 항체를 loading control로 사용하였습니다.