CRISPR-Cas9 스크리닝 라이브러리

Functional genomics screeing을 위한 CRISPR 라이브러리

CRISPR 스크리닝을 사용하면 관련 유전자 세트 또는 custom collections에 초점을 둔 기능 상실 분석이나 편향되지 않은 genome-wide 범위의 CRISPR 스크리닝을 자신 있게 수행할 수 있습니다.

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Lentivirus gRNA 라이브러리를 사용하여 CRISPR 스크리닝 성능을 확대하십시오. Lentivirus 라이브러리를 사용하면 수백 개의 유전자에 대한 CRISPR 유전자 편집을 한 번에 손쉽게 수행할 수 있습니다. 수상 경력이 있는 Invitrogen LentiArray 및 LentiPool CRISPR 라이브러리는 고급 gRNA 설계를 사용하여 특이성을 방해하지 않으면서 knockout 효율을 극대화합니다. 

CRISPR 라이브러리는 최신 연구와 당사의 광범위한 자체적 경험을 통합한 당사의 독점 gRNA 설계 알고리즘을 사용하여 제작됩니다. gRNA 설계는 특이성을 저하시키지 않으면서 최대 knockout 효율을 위해 선택됩니다. 각 유전자 타겟에 대해 Lentivirus 라이브러리가 광범위한 세포 유형에서 타겟 유전자의 고효율 knockout을 제공할 수 있도록 최대 4개의 고품질 gRNA가 포함됩니다.

LentiArray CRISPR 라이브러리는 96-well plate에서 배열된 형식으로 제공되며 high-throuput의 스크리닝 플랫폼과 호환됩니다. 이 Lentivirus 라이브러리는 기능적 유전체 assay 설계 또는 연구 목표에 한계를 부과하지 않는 유연한 시스템을 제공합니다. 

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LentiPool CRISPR 라이브러리는 고처리량의 인프라 없이도 CRISPR-Cas9 스크리닝을 가능하게 합니다. 풀링된 이러한 고품질 Lentivirus 라이브러리는 당사의 LentiArray 라이브러리와 동일한 유전자 표적을 포함하며 최대 영향을 미치는 유전자 knockout 스크리닝을 위해 바로 사용 가능한 높은 역가(>1 x 10⁸ TU/mL)의 Lentivirus 입자로 제공됩니다.

LentiPool CRISPR 라이브러리에는 하나의 튜브에 함께 풀링된 각 타겟 유전자에 대해 최대 4개의 gRNA를 인코딩하는 Lentivirus가 포함되어 있습니다. 모든 분석은 차세대 염기서열분석(NGS)을 사용하여 수행할 수 있습니다. 당사의 LentiPool 라이브러리는 gRNA 및 유전자 표현을 확인하기 위해 NGS로 품질 관리됩니다.

	Cas9 발현 세포 생성: LentiArray Cas9 Lentiviurs 입자를 사용한 세포 Lentivirus 형질 도입 Blasticidin을 사용한 선택 Resistant cell의 증식
	Pooling된 sgRNA 라이브러리를 사용한 transfection LentiPool sgRNA 라이브러리를 사용한 Cas9 발현 세포의 Lentiviurs 형질 도입 Puromycin을 사용한 선택 내성 세포의 증식
	Positive 혹은 negative selection으로 1차 스크리닝:  Positive selection(+): 세포 처리 적용(예: 약물, 화학적 교란) Negative selection(–): 세포를 참조 및 실험 시료로 나눕니다. Selective pressure 또는 처리를 실험 시료에만 적용합니다.
	NGS로 HIT 식별 유전체 DNA로부터 enrich된[양성 선택(+)] 또는 depleted된[음성 선택(–)] sgRNA의 high-throughput 염기서열 분석

그림 2.Lentivirus 풀링 스크리닝을 위한 워크플로우. Blasticidin 내성에 대한 선택을 이용하여 LentiArray Lentiviral Cas9 nuclease로 Cas9-발현 안정 세포주가 생성됩니다. 이 Cas9 발현 세포는 적합한 MOI에서 LentiPool sgRNA 라이브러리로 transfection되며 puromycin 내성에 대한 선택을 거칩니다. 그러면 transfection된 모집단이 약물 또는 chemical perturbant과 같은 selective pressure 또는 treatment를 거칩니다. 유전체 DNA는 분리되고 sgRNA insert는 PCR을 통해 증폭됩니다. 마지막으로, 처리에 반응하여 농축된/고갈된 유전자를 판단하기 위해 앰플리콘의 염기서열이 분석됩니다.

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고품질의 control은 high-throughput 스크리닝의 성공적인 개발 및 성능에 있어 중요한 역할을 합니다. 전달 조건을 최적화하고 편집 효율을 극대화하며 HIT 선택 기준을 설정하는 데 도움이 되도록 control 주문이 필요합니다.

LentiArray CRISPR 라이브러리에 특정하여 당사는 GFP 발현 구조 유무에 관계없이 제공할 수 있는 음성 또는 양성 전달 control 세트 옵션을 제공합니다. GFP marker는 시각적 측정치를 제공하여 바이러스 전달 조건의 빠른 최적화에 도움이 될 수 있습니다.

이 CRISPR 라이브러리는 유전자 타겟 당 최대 4개의 gRNA와 함께 well 당 하나의 유전자를 포함합니다. Lentivirus 라이브러리는 다음과 같은 두 가지 형식으로 제공됩니다.

• 1 x 10⁸ TU/mL의 평균 역가로 유전자 타겟당 100 μL(2 x 50 μL)의 즉시 사용 가능한 Lentivirus 입자
• gRNA당 50 μL로 제공되는 글리세롤 스톡. 이는 자체 풀링 또는 배열된 라이브러리를 생성하기 위한 저장소로 사용할 수 있습니다. 이 형식을 사용하려면 플라스미드 준비와 Lentivirus 패키징이 필요합니다.

특정 유전자 세트부터 전 유전체 라이브러리에 이르기까지 확립된 맞춤형 CRISPR 라이브러리가 둘 다 제공됩니다. 당사의 신약 가능성 유전체 CRISPR 라이브러리는 질병의 발달과 진행에 관여하는 잠재적인 치료 타겟을 식별하도록 설계되었습니다.

각 CRISPR 라이브러리의 유전자 타겟은 NCBI RefSeq 데이터베이스를 비롯한 최신 유전체 데이터베이스를 사용하여 선택되었으며, Gene Ontology Consortium(GO) 데이터베이스 및/또는 HUGO Gene Nomenclature Committee(HGNC)에 교차 참조되었습니다. 그런 다음 Thermo Fisher Scientific 소속 과학자가 개발한 독점 설계 알고리즘을 사용하여 각 타겟에 맞는 gRNA 설계를 생성하였습니다. 

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*유전자 수 및 gRNA 수는 변경될 수 있습니다.