HCS 및 HCA 샘플 데이터

새로운 CellInsight CX7 Pro 플랫폼을 사용하여 가능해진 고처리량 이뮤노어세이(immunoassay) 스크리닝

CellInsight CX7 및 CX7 Pro 장비에서 FirePlex™-HT no-wash immunoassay 비교. 고처리량 스크리닝을 위해 최적화된 no-wash FirePlex assay는 웰당 5 및 10개의 분석물을 검출하기 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 10 포인트 표준 곡선이 어세이 분석물 재현성과 동적 범위 창으로 정량화되었습니다. 그 결과 어세이는 CellInsight CX7(왼쪽 이미지) 또는 CX7 Pro(오른쪽 이미지) 플랫폼을 사용하여 측정했으며 FirePlex Analysis Workbench 소프트웨어를 사용하여 정량되었습니다. CX7 Pro 장비(오른쪽 이미지)만 2.5(15-비트) 또는 3.0(16-비트) 동적 범위를 초과하고 플레이트내 변동계수(intra-plate CV)가 15% 미만입니다. CX7 Pro 기기의 우수한 광학 및 95% QE 검출 기능으로 인해 크게 동적 범위 및 재현성 성능이 향상되었습니다. 이 실험은 HT-스크리닝 고려 사항을 위해 15- 및 16-비트 CX7 Pro sCMOS 카메라 모드를 사용하여 Abcam ™ 으로 검증되었습니다.

면역-종양학 응용 분야: 유방암 spheroid에서 항체-의존 세포 사멸 이미징

유방암 spheroid에서 항체-의존 세포 사멸.  Dynabeads Untouched Human NK Cells Kit로 분리된 Human natural killer(NK) 세포를 CellTracker Deep Red dye로 레이블링했습니다. 인간 유방암 세포(SKBR3)는 Nunclon Sphera 96-well plate에서 하룻밤 사이에 성장하여 spheroid를 형성했으며, anti-HER2 항체 Trastuzumab으로 처리 후 4시간 동안 NK 세포에 대항했습니다. 세포를 CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent 및 Hoechst 33342로 염색했고 CellInsight CX7 LZR High-Content Screening에서 촬영했습니다. 플랫폼. 이미지는 여러 Z 단면을 최대 강도로 투사한 것입니다. CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent는 spheroid에서 NK 세포와 항체 매개 세포사멸을 연구하는 데 사용되었습니다. CellTracker Deep Red는 spheroid 내에서 NK 세포를 추적하는 데 사용되었습니다. SKBR3 세포의 HER2에 결합된 Trastuzumab은 항체 의존 세포의 사멸을 통해 NK 세포 anti-tumor 반응을 증폭시킵니다.

spheroid 이미징 및 분석 응용 분야: EdU 증식 및 spheroid 크기의 분할 및 정량

CellInsight CX7 LZR 시스템을 사용한 EdU 및 spheroid 크기의 분할 및 정량. A549 세포는 Nunclon Sphera 96U-웰 마이크로플레이트에서 웰당 5,000개 세포 밀도로 플레이팅된 후 CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양되었습니다. EdU를 10µM의 최종 농도로 추가하고 1시간 동안 배양했습니다. 그런 다음 spheroid를 세척하고 4% 포름알데히드로 고정했으며 0.25% Triton X-100으로 투과시켰습니다. 그 후 키트 프로토콜에 따라 Click-iT EdU Alexa Fluor 488 HCS Assay Kit를 사용하여 EdU에 대해 spheroid를 염색했습니다. CellInsight CX7 LZR High Content Screening Platform의 공초점 모드를 사용하여 4x 대물렌즈로 해당 플레이트를 촬영했습니다. 이미지는 각각 1 micron의 200 광학 z 절편을 최대 강도로 투영한 것입니다. HCS Studio 2.0 소프트웨어에서 Morphology Explorer 바이오애플리케이션을 사용하여 정량화를 수행했습니다. spheroid를 하나의 개체로 분할했고, EdU 양성 세포는 spheroid 내에서 스폿으로 계산했습니다. Morphology Explorer 바이오애플리케이션을 사용하여 spheroid를 전체 개체로 분할했고 EdU 양성 세포는 spheroid 내부에서 분할되고 세포 수를 플로팅했습니다.

바이오애플리케이션용 라이브 세포 모드에서 3D spheroid의 공초점 이미징

라이브 세포 모드에서 3D spheroid의 공초점 이미징 (A) A549 세포는 U-bottom 플레이트에서 5,000/웰 밀도로 플레이팅되어 CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 배양되었습니다. 살아있는 세포와 죽은 세포에 대해 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit를 사용하여 라이브 spheroid를 레이블링했습니다. 해당 플레이트는 CellInsight CX7 LZR HCS 기기의 공초점을 사용하여 10x 대물렌즈로 자동으로 촬영되었습니다. 이미지는 여러 z-절편을 최대 강도로 투영한 것입니다. 죽은 세포는 spheroid 핵(적색)에서 관찰되었고 살아있는 세포(녹색)는 spheroid 주변에서 관찰되었습니다. (B) A549 세포는 U-bottom 플레이트에서 5,000/웰 밀도로 플레이팅된 후 CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양되었습니다. 그런 다음, 살아있는 spheroid를 MitoTracker Orange CMTMRos 및 CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent로 30분 간 염색했습니다. 플레이트는 CellInsight CX7 LZR HCS 기기의 공초점을 사용하여 10x 대물렌즈로 자동으로 촬영되었습니다. 이미지는 여러 Z 절편을 최대 강도로 투영한 것입니다. 살아있는 A549 spheroid에서, 대부분의 세포는 MitoTracker Orange 염색으로 보았듯이 건강하며, 극소수의 apoptotic 세포가 관찰되었습니다. (C) A549 세포는 U-bottom 플레이트에서 5,000/웰 밀도로 플레이팅된 후 CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양되었습니다. 그런 다음, 살아있는 spheroid를 Image-iT Green Hypoxia Reagent로 30분 간 염색했습니다. 플레이트는 CellInsight CX7 LZR HCS 기기의 공초점을 사용하여 10x 대물렌즈로 자동으로 촬영되었습니다. 이미지는 여러 z-절편을 최대 강도로 투영한 것입니다. 살아있는 A549 spheroid는 Image-iT Green Hypoxia Reagent로 염색하여 hypoxia 염색을 나타냅니다. (D) SKBR3 세포는 U-bottom 플레이트에서 5,000/웰 밀도로 플레이팅된 후 CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양되었습니다. 그런 다음 살아있는 spheroid를 pHrodo Red conjugated Herceptin 항체를 사용하여 24시간 동안 배양했습니다. 해당 플레이트는 CellInsight CX7 LZR HCS 기기의 공초점을 사용하여 4x 대물렌즈로 자동으로 촬영되었습니다. 이미지는 여러 z-절편을 최대 강도로 투영한 것입니다. 내면화된 pHrodo conjugated Herceptin 항체는 세포 내 소포에서 관찰됩니다. (E) neurosphere는 Culture One Supplement를 사용하여 Neurobasal Plus Medium에서 신경줄기세포(NSC)와 구분했습니다. 그런 다음, 라이브 neurosphere를 Tubulin Tracker Deep Red로 1시간 동안 염색했습니다. 해당 플레이트는 CellInsight CX7 LZR HCS 기기의 공초점을 사용하여 4X 대물렌즈로 자동으로 촬영되었습니다. 이미지는 여러 z-절편을 최대 강도로 투영한 것입니다. Tubulin Tracker Deep Red는 NSC와 구별되는 신경구의 신경돌기를 염색합니다. (F) HeLa 세포를 U자형 바닥 플레이트에 5,000/웰의 밀도로 플레이팅하고 CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양했습니다. 활성화된 T 세포는 CellTracker Deep Red로 레이블링되었으며 각 웰에 약 5,000개의 세포가 추가되었습니다. 활성화된 T 세포와 함께 2시간 배양 후, spheroid는 pHrodo Green AM Intracellular pH Indicator로 30분 간 염색되었습니다. 그런 다음 세포를 PBS로 3번 세척하고 CellInsight CX7 LZR HCS 기기에서 공초점을 사용하여 4x 대물렌즈로 촬영되었습니다. 이미지는 여러 z-절편을 최대 강도로 투영한 것입니다. 활성화된 T 세포 추가 시 pHrodo Green AM 형광에서 세포 내 증가.

spheroid에서 증식 세포 이미징 및 분석

HeLa spheroid에서 증식 세포 분석. HeLa 세포를 Nunclon Sphera U-bottom 플레이트에서 5,000/웰 밀도로 플레이팅한 후 CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양했습니다. spheroid는 24시간 동안 50µM hydroxyurea로 처리되었습니다. 그런 다음 spheroid는 10µM 5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU)으로 30분 간 펄스되었습니다. 그 후 PBS로 spheroid를 세척하고 Click-iT EdU Alexa Fluor 488 HCS Assay를 사용하여 증식 세포에 염색했습니다. 그런 다음 spheroid를 세척하고 Alexa Fluor 647 dye에 콘주게이트된 Ki67 항체로 염색했습니다. spheroid는 CellInsight CX7 LZR HCS 기기의 공초점을 사용하여 10x 대물렌즈로 자동으로 촬영되었습니다. 이미지는 여러 z-절편을 최대 강도로 투영한 것입니다. spheroid는 개체로 분할되고, EdU 및 Ki67 양성 세포는 spheroid 내에서 puncta로 정량화되었습니다. EdU 및 Ki67 양성 세포 모두 대조군 spheroid에서 관찰되었습니다. 수산화요소로 처리된 spheroid에서, 활발하게 증식하는 S-phase 세포가 사라지고(EdU 음성) Ki67 양성 세포만 관찰되었습니다.

면역-종양학 응용 분야: T 세포 침투 및 폐암 spheroid 사멸 이미징

T 세포 침투 및 폐암 spheroid 사멸. spheroid는 Nunclon Sphera U-bottom 플레이트에서 Gibco Minimal Essential Medium(MEM)을 사용하여 A549 세포를 시딩하고 2일 동안 배양하여 형성되었습니다. Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28을 사용하여 human PBMC에서 분리한 T 세포는 72시간 동안 활성화되었고 4시간 동안 폐암 spheroid에 추가하여 CellTracker Deep Red Dye로 레이블링되었습니다. 세포는 CellEvent Caspase 3/7 Reagent로 레이블링되었습니다. CellInsight CX7 LZR High-Content Platform에서 라이브 세포 전체 spheroid 이미징을 사용하여 T 세포 침투 및 종양 세포 독성을 평가했습니다. 활성화된 T 세포는 CellEvent Caspase 3/7 Reagent(녹색)로 염색도의 증가에서 보이는 바와 같이, spheroid(적색)를 침투하고 spheroid 전체에서 표적 세포의 apoptosis를 유도했습니다.