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Real-Time PCR(qPCR) 실험 결과를 계산할 때 절대 정량 또는 상대 정량을 사용할 수 있습니다.
| 절대 정량 (디지털 PCR법) | 절대 정량(표준 곡선법) | 상대 정량 | |
|---|---|---|---|
| 개요 | 디지털 PCR을 이용한 절대 정량에는 확인된 표준물질이 필요하지 않습니다. 관심 타겟은 디지털 PCR 복제(replicate) 수로 측정된 정밀도로 직접 정량할 수 있습니다. | 표준 곡선법을 사용한 절대 정량에서는 확인된 양에 기초하여 미지의 물질을 정량 분석합니다. 먼저 표준 곡선을 만든 다음 미지의 양을 표준 곡선과 비교하여 값을 외삽합니다. | 상대 정량에서는 다른 참조 샘플(예: 비처리 대조 샘플)과 비교하여 주어진 샘플의 유전자 발현 변화를 분석합니다. |
| 예 | 이형질 혼합물에 존재하는 희귀 대립 유전자의 복제를 정량합니다. 게놈 DNA를 타겟으로 하여 샘플 중의 세포와 동등한 물질의 수를 셉니다. 표준물질을 참조하지 않고 주어진 샘플에 존재하는 바이러스 복제의 절대 개수를 측정합니다. | 질병 상태와 바이러스 복제 수의 상관 관계. | 약물에 대한 반응으로 유전자 발현 측정. 이 예에서는 화학 처리된 샘플에서 특정 관심 유전자의 유전자 발현 수준을 미처리 샘플의 유전자 발현 수준과 비교합니다. |
디지털 PCR은 샘플을 다수의 개별적 Real-Time PCR 반응으로 분할하여 작용합니다. 이러한 반응의 일부는 타겟 분자를 포함하거나(양성) 포함하지 않습니다(음성). PCR 분석 이후 음성 반응 부분은 표준물질 또는 내생 대조군에 대한 참조 없이 샘플의 타겟 분자의 정확한 절대 값을 생성하는데 사용됩니다.
그림 1: 디지털 PCR은 양성(흰색)과 음성(검은색) PCR 반응의 비율을 사용하여 타겟 분자의 수를 계산합니다.
절대 정량을 위한 표준 곡선법은 상대 정량을 위한 표준 곡선법과 유사하지만 먼저 표준물질의 절대량이 독립적인 방법으로 확인되어야 합니다.
그림 2: 절대 정량을 위한 증폭 플롯 및 표준 곡선
주요 가이드라인
아래의 가이드라인은 절대 정량을 위한 표준 곡선법의 적절한 사용을 위해 중요합니다.
- DNA나 RNA가 순수한 단일 종인 것이 중요합니다. 예를 들어, E. coli로부터 제조된 플라스미드 DNA는 종종 RNA로 오염되어 A260 측정치를 증가시키고 플라스미드에서 측정되는 복제 수를 늘립니다.
- 표준물질을 수십배 이상 희석해야 하기 때문에 정확한 피펫팅이 필요합니다. 정확한 A260 값을 측정하려면 플라스미드 DNA 또는 in vitro 전사된 RNA가 농축되어야 합니다. 그 다음, 이 농축된 DNA 또는 RNA를 106-1012배로 희석하여 생물학적 샘플 중의 타겟과 비슷한 농도로 만들어야 합니다.
- 특히 RNA의 경우 희석된 표준물질의 안정성이 고려되어야 합니다. 희석된 표준물질을 작은 분액으로 나누어 -80°C에서 보관하고 사용 전에 한 번만 해동합니다.
역전사 단계의 효율성을 평가하기 위한 대조 물질이 없으므로 RNA의 절대 정량을 위한 표준으로 DNA를 사용하는 것은 일반적으로 불가능합니다.
표준물질
먼저 표준물질의 절대량이 독립적인 방법으로 확인되어야 합니다. 플라스미드 DNA 및 in vitro 전사된 RNA는 일반적으로 절대 표준물질을 준비하는데 사용됩니다. 농도는 A260으로 측정하고 DNA 또는 RNA의 분자량을 사용하여 복제 수로 변환합니다.
상대 정량을 위한 계산 방법
상대 정량은 모든 Real-Time PCR 장비의 데이터를 사용하여 수행할 수 있습니다. 상대 정량에 사용되는 계산 방법은 다음과 같습니다.
- 표준 곡선법
- Comparative CT법
그림 3: 상대 정량
개요 | ||
| 디지털 PCR법 | 표준 곡선법 | Comparative CT법 |
|---|---|---|
| 핵산 정량은 많은 기술적 복제 PCR 반응에 걸쳐 확산되는 샘플 희석 제한 이론을 이용합니다. 절대 정량은 음성 반응 대 전체 반응의 비율로 결정됩니다. 이 유형의 분석은 Ct 및 델타 Ct 비교와 다르며, 대신 참조 표준물질을 필요로 하지 않고 각 분석 타겟을 독립적으로 정량할 수 있습니다. | 비처리 대조군과 같은 일부 기본 샘플(calibrator라고 부름)에 상대적으로 양을 표현하기 때문에 상대 정량를 위한 표준 곡선을 쉽게 준비할 수 있습니다. 모든 실험 샘플에 대해 표준 곡선으로부터 타겟의 양을 측정하고 캘리브레이터(calibrator)의 타겟 양으로 나눕니다. 따라서 캘리브레이터는 1X 샘플이 되고, 다른 모든 수량은 캘리브레이터와 비교하여 n배의 차이로 표시됩니다. | 이 방법은 하나의 타겟 유전자의 Ct 값을 다른 타겟 유전자와 비교합니다(공식: 2ΔΔCT)—예를 들어, 단일 샘플의 내부 대조 또는 참조 유전자(예: 하우스키핑 유전자). |
장점 | ||
| 참조물질이나 표준물질에 의존할 필요 없음. PCR 복제의 총 수를 증가시킴으로써 원하는 정밀도를 달성할 수 있음. 저해제에 높은 내성. 복잡한 혼합물을 분석할 수 있음. 전통적 qPCR과 달리 디지털 PCR은 존재하는 복제 수에 대한 선형 반응을 제공하여 소규모 변화의 차이를 검출할 수 있음 | 개별 튜브에서 타겟 및 내생 대조군의 증폭을 실행하고 표준 곡선법을 사용하려면 최소한의 최적화 및 검증이 필요합니다. | 표준 곡선이 필요하지 않고 표준 곡선 샘플을 위해 사용되는 웰(well)이 더 이상 필요하지 않기 때문에 처리량이 증가합니다. 또한 표준 곡선 샘플을 생성할 때 발생하는 희석 오류가 제거됩니다. 동일한 튜브에서 타겟 및 내생 대조군을 증폭시켜 처리량을 늘리고 피펫팅 오류를 줄일 수 있습니다. RNA가 템플릿인 경우, 동일한 튜브에서 증폭을 수행하면 RNA 무결성 및 역전사 효율과 같은 변수에 대한 정규화가 이루어집니다. |
실험적 검증 | ||
| 검증된 디지털 PCR 결과를 복제 수가 확인되고 특성이 잘 규명된 샘플과 나란히 비교합니다. | 위의 장점 부분을 참조하십시오. | 타겟 및 내생 대조군의 증폭 효율이 거의 동일하다는 것을 보여주기 위해 검증 실험을 수행해야 합니다. |
주요 가이드라인 | ||
| 실험 셋업 중에 가능한 낮은 결합력의 플라스틱을 사용하는 것이 중요합니다. 디지털 PCR은 희석을 제한하는 어세이를 강조하기 때문에 중간 셋업 장비에 달라 붙는 샘플이 손실되어 결과가 왜곡됩니다. 희석을 위해 낮은 결합력의 2.0mL 튜브 및 낮은 잔류성의 피펫 팁을 사용할 것을 권장합니다. 검사할 샘플의 디지털 영역을 아는 것이 중요합니다. 알 수 없는 경우, 사용자 안내서에서 확인된 종(gDNA)의 복제 수 결정에 대한 부분을 참조하거나 의미 있는 데이터를 얻기 위한 최적의 디지털 농도를 결정하기 위해 여러 샘플/어세이 조합의 희석액으로 예비 스크리닝 실험을 수행합니다. 샘플은 장시간 낮은 농도로 보관하거나 과도한 동결-융해에 노출되면 안 됩니다. 실험 셋업을 위해 비점착성 플라스틱 제품을 사용하는 것만큼이나 캐리어(carrier)는 재현성에 중요하지 않은 것으로 확인되었습니다. 희석 계획에 따른 변동성을 최소화하기 위해서는 희석 계획을 세심하게 수립하는 것이 바람직합니다. | 스톡(stock) RNA 또는 DNA를 정확하게 희석하는 것이 중요하지만 이 희석을 표현하는 데 사용되는 단위는 상관없습니다. 대조 세포주에서 총 RNA 전처리물을 2배 희석하여 표준 곡선을 만들면 단위는 희석 값 1, 0.5, 0.25, 0.125 등이 될 수 있습니다. 동일한 스톡(stock) RNA 또는 DNA를 사용하여 여러 개의 플레이트에 대한 표준 곡선을 만들면 결정된 상대적인 양을 플레이트 간에 비교할 수 있습니다. RNA의 상대적 정량을 위해 DNA 표준 곡선을 사용할 수 있습니다. 여기서는 타겟의 역전사 효율이 모든 샘플에서 동일하다고 가정하지만 이 효율의 정확한 값을 알 필요는 없습니다. 내생 대조(endogenous control)로 정규화된 정량의 경우, 표준 곡선은 타겟 및 내생 참조 모두를 위해 준비됩니다. 각 실험 샘플에 대해 타겟 및 내생 참조의 양이 적절한 표준 곡선으로부터 측정됩니다. 그런 다음 타겟의 양을 내생 참조의 양으로 나누어 정규화된 타겟 값을 얻습니다. 다시 말하자면 실험 샘플 중 하나는 캘리브레이터(calibrator) 즉, 1X 샘플입니다. 각각의 정규화된 타겟 값을 캘리브레이터 정규화 타겟으로 나누어 상대적인 발현 수준을 생성합니다. | Comparative CT법을 검증하기 위해서는 타겟 증폭 효율(관심 유전자)과 참조 증폭 효율(내생 대조)이 거의 동일해야 합니다. |
내생 대조(endogenous control) | ||
| 디지털 PCR은 참조 측정을 위해 내생 대조의 존재에 의존하지 않습니다. | 내생 대조의 증폭은 반응에 첨가된 샘플 RNA 또는 DNA의 양을 표준화하기 위해 수행될 수 있습니다. 유전자 발현의 정량을 위해 연구자들은 ß-actin, GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 리보솜 RNA(rRNA) 또는 기타 RNA를 내생 대조로 사용해왔습니다. | |
표준물질 | ||
| 디지털 PCR은 총 복제(replicate) 수에 대한 음성 반응의 비율을 사용하여 분자의 절대 개수를 측정하기 때문에 표준물질이 필요하지 않습니다. | 샘플 양을 캘리브레이터의 양으로 나누기 때문에 표준 곡선에서 단위가 나타나지 않습니다. 따라서 표준물질에 요구되는 모든 것은 상대적인 희석 수준을 밝히는 것입니다. 이는 상대 정량의 경우, 표준물질을 준비하기 위해 적절한 타겟을 포함하고 있는 모든 스톡(stock) RNA 또는 DNA를 사용할 수 있음을 의미합니다. |
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.