Real-Time PCR: C_t 이해하기

정량적 PCR 또는 qPCR이라고도 하는 Real-Time PCR은 샘플에 존재하는 타겟 서열이나 유전자의 양을 측정하는 간단하면서도 고급의 방법을 제공할 수 있습니다. 높은 단순성으로 인해 때로는 작용에 관여하는 몇 가지 중요한 요소를 간과하게 될 수 있습니다. 이 리뷰에서는 Real-Time PCR 반응을 설정하고 평가할 때 고려해야 하는 이러한 요소들을 강조합니다.

C_t에 영향을 줄 수 있는 요소

C_t(역치 사이클)는 증폭 곡선과 역치선 사이의 교차점입니다(그림 1B). 이것은 PCR 반응에서 타겟 농도의 상대적 측정값입니다. 다양한 요소가 타겟 농도 이외에 C_t의 절대값에 영향을 미칩니다. C_t에 영향을 줄 수 있는 가장 일반적인 템플릿-독립적 요소에 대해 논의하고 Real-Time PCR 반응의 성능을 평가하는 방법을 설명합니다.

위의 그림 1은 실시간 반응 증폭 플롯의 몇 가지 파라미터를 나타냅니다. 그림 1B의 익스포넨셜 단계는 그림 1C의 선형 단계(linear phase)에 상응합니다. 역치는 그림 1C에 있는 증폭 플롯의 선형 단계에 설정되어야 합니다. C_t 값은 템플릿의 양이 감소할수록 증가합니다. 그러나 C_t 계산과 관련된 형광 측정값을 변경하는 반응 믹스 또는 장비의 아티팩트(artifact)는 C_t 값의 템플릿-독립적인 변화를 초래합니다. 따라서 PCR 반응의 C_t 값은 각기 다른 조건 하에서 또는 각기 다른 시약과 함께 직접 비교될 수 없습니다. 

그림 2.  동일한 ROX 수준을 갖는 두 가지 마스터 믹스를 사용한 하나의 어세이에서 얻은 원시(raw) 형광 데이터. 신호의 차이는 마스터 믹스의 조성 때문입니다. 반응은 Applied Biosystems™ VIC™/MGB 프로브를 사용하는 Applied Biosystems™ 7900HT Fast Real-Time PCR 시스템에서 수행되었습니다. X축은 형광단의 방출 파장을 나타내고 Y축은 방출의 강도를 나타냅니다.

분자의 형광 방출은 용액의 pH 및 염 농도와 같은 환경적 요소에 따라 달라집니다. 그림 2는 두 개의 서로 다른 마스터 믹스 백그라운드에서 Applied Biosystems™ TaqMan 프로브의 원시(raw) 형광 데이터를 나타냅니다. 두 경우 모두 타겟, 프로브 및 ROX 염료 농도가 동일하더라도 마스터 믹스 A에서 형광 강도가 더 높습니다.

따라서 ΔRn 값은 그림 3과 같이 달라집니다. 템플릿-무의존적 요소의 기준 형광 신호는 두 개의 마스터 믹스에서 다릅니다(그림 3A). C_t 값의 변화는 반응 시스템의 전반적인 성능을 반영하지 않습니다(그림 3B). 동일한 감도를 가진 마스터 믹스가 다른 절대 C_t 값을 가질 수 있습니다.

그림 3. 마스터 믹스 A와 마스터 믹스 B를 사용하여 같은 양의 인간 gDNA에서 RNase P를 증폭합니다. (A) Rn을 사이클 수에 대해 플롯(plot)하고 두 반응에 대한 기준선을 표시합니다. (B) 로그 (ΔRn)은 사이클 수에 대해 플롯됩니다. 역치(녹색 선)는 두 마스터 믹스 모두에 대해 동일한 수준으로 설정됩니다. 마스터 믹스 B의 C_t 값(C_tB)은 동일한 농도의 타겟에 대해 마스터 믹스 A(C_tA)의 값보다 빠르며 이는 마스터 믹스 B의 낮은 기준선을 반영합니다. 모든 증폭은 Applied Biosystems™ 7500 Real-Time PCR 시스템을 사용하여 수행되었습니다.

Rn 값은 Applied Biosystems™ FAM™ 염료의 형광을 ROX 염료의 형광으로 나눈 비율로 계산됩니다. 따라서 FAM 염료의 형광 신호가 변하지 않는다고 가정할 때 ROX 염료의 양이 적으면 더 높은 Rn 값이 생성됩니다. 이는 기준선 Rn의 증가로 이어지며 결과적으로 ΔRn이 작아질 뿐만 아니라 C_t 값이 달라집니다. ROX 염료의 수준을 낮추어 얻은 새로운 C_t 값은 반응의 진정한 감도에 영향을 미치지 않지만 다른 의도치 않은 결과를 초래할 수 있습니다. 그림 4에서 보듯이 ROX 염료의 낮은 농도가 C_t 값의 표준 편차를 높일 수 있습니다. 표준 편차가 클수록 타겟 농도의 작은 차이를 구별하는 신뢰도가 낮아집니다(아래 정밀도 섹션 참조).

그림 4.  3가지 농도의 ROX 염료를 함유한 마스터 믹스를 이용한 TGF-β의 증폭. ROX 염료 농도와 (A) C_t 값 및 (B) 표준 편차의 변화가 표시됩니다. ROX 염료 농도를 낮추면 더 일찍 C_t가 나오지만 표준 편차는 증가합니다. 모든 증폭은 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR 시스템을 사용하여 수행하였습니다.

PCR 반응의 효율 또한 C_t에 영향을 줄 수 있습니다. 저효율 조건에서 증폭된 희석 시리즈는 고효율 조건에서 증폭된 것과는 다른 기울기를 갖는 표준 곡선을 산출할 수 있습니다. 그림 5에서 저효율 조건 및 고효율 조건에서 증폭 된 두 샘플(X 및 Y)은 동일한 타겟 농도에 대해 각기 다른 C_t 값을 나타냅니다. 이 예에서, 고효율 조건(그림 5의 파란색 곡선)은 높은 농도에서 늦은 C_t를 제공하지만 낮은 타겟 농도에서 더 높은 감도를 제공합니다. PCR 효율은 어세이, 마스터 믹스 성능 및 샘플 품질에 따라 다릅니다. 일반적으로 90%와 110% 사이의 효율은 허용 가능한 것으로 간주됩니다. 다른 하나는 장비, 시약 및 어세이과 같은 다른 모든 요소가 동등하다고 가정할 때 첫 번째 샘플에 템플릿이 적다는 결론을 내리는데 유용할 수 있습니다. 그러나 두 가지 C_ts를 생산하는데 다른 장비, 시약, 프라이머 및 프로브 또는 반응 부피가 관련되어 있다면 이는 사실이 아닙니다. 따라서 Ct 절대값 비교는 위에 정 된 것과 동일한 반응 조건을 사용하는 실험을 비교할 때만 의미가 있습니다.

그림 5. PCR 효율에 따른 C_t 의 변화. 파란색 표준 곡선은 효율이 100%입니다(기울기는 –3.3). 녹색 표준 곡선은 효율이 78%입니다(기울기는 -4). 양(Quantity) Y의 증폭은 고효율 조건(파란색)에 비해 낮은 효율 조건(녹색)에서 초기 C_t를 제공합니다. 낮은 양(X)에서는 반전이 발생하고 낮은 효율 조건(녹색)은 고효율 조건(파란색)보다 늦은 C_t를 제공합니다.

조건이 변경되는 두 가지 반응(예: 두 가지 다른 마스터 믹스 또는 두 가지 다른 장비)을 비교하려면 다음 파라미터를 평가해야 합니다.

동적 범위(Dynamic range)

PCR 효율을 적절하게 평가하기 위해서는 최소 3회 반복과 최소 5로그의 템플릿 농도가 필요합니다. 이 권장 수준의 이유는 그림 6에 나와 있습니다. 그림 6은 1로그(Log)와 5로그(Log)의 희석을 비교하여 검사할 때 기울기 또는 효율성의 수학적 변형이 가능함을 나타냅니다. 따라서 분석의 효율이 100%이더라도 하나의 희석에 표준 편차가 있기 때문에 단일 로그의 희석 시리즈를 검사할 때 70 ~ 170%의 범위를 얻을 수 있습니다. 5로그 범위에서 동일한 수의 희석 또는 복제물에 대해 잠재적 아티팩트는 ±8%에 불과합니다. 이는 5로그 범위에서 94% 효율을 의미하며 어세이의 효율은 88% ~ 100%가 됩니다. PCR 반응의 효율을 정확하게 결정하기 위해서는 5로그 희석 시리즈를 수행해야 합니다. –3.3 ±10%의 기울기는 100% ±10%의 효율을 반영합니다. PCR 반응의 효율이 낮으면 감도가 낮습니다.

R² 값

PCR 효율을 평가하는 또 다른 중요한 파라미터는 R²입니다. R2는 하나의 값이 다른 값을 예측하는데 얼마나 좋은지 나타내는 통계 용어입니다. R²이 1이면 Y(Ct) 값을 사용하여 해당 값을 정확하게 예측할 수 있습니다(그림 7A). R²이 0이면 Y 값으로 X 값을 예측할 수 없습니다(그림 7B). R² 값이 0.99를 초과하면 두 값의 상관관계에 대한 높은 신뢰도를 제공합니다.

정밀도

표준 편차(분산의 제곱근)는 가장 일반적인 정밀도 척도입니다. 많은 데이터 포인트가 평균에 가까우면 표준 편차가 작습니다. 많은 데이터 포인트가 평균에서 멀리 떨어져 있으면 표준 편차가 큽니다.

실제로 충분한 반복 횟수를 가진 데이터 세트는 대략적으로 정규 분포를 형성합니다. 이는 독립적으로 동일하게 분포한 많은 확률변수의 합이 정규 분포를 향해 무한대로 이어지는 고전적인 중심극한정리(central limit theorem)에 의해 정당화되는 경우가 많습니다. 그림 8A에서 보듯이 값의 약 68%는 평균의 1개 표준 편차 내에 있고, 95%는 2개 표준 편차 내에 있고, 99.7%는 3개 표준 편차 내에 있습니다.

PCR의 효율이 100%이면 2배 희석에서 2개의 연속 농도 간 C_t 차이는 1입니다(그림 8B). 99.7% 이상의 경우에서 2배 희석을 정량화할 수 있으려면 표준 편차가 0.167 이하여야 합니다. 표준 편차가 클수록 2배 희석을 구별하는 능력이 낮아집니다. 95% 이상의 경우에서 2배 희석 간 구별이 가능하려면 표준 편차가 0.250 이하여야 합니다(그림 8C).

감도

시작 템플릿의 1회 복제를 증폭 및 검출할 수 있는 시스템은 C_t의 절대값에 관계 없이 궁극적인 감도 수준을 달성하였습니다.

앞에서 설명한 것처럼 효율은 반응의 감도를 결정하는 핵심 요소입니다(그림 5). 매우 낮은 복제 수를 검출할 때의 또다른 주요 고려 사항은 템플릿의 정규 분포가 예상되지 않는다는 것입니다. 대신 시작 템플릿의 1회 복제의 평균을 포함하는 많은 수의 반복에서 약 37%는 복제수가 없어야 하고, 37%만 1회 복제를 포함하고, 18%는 2회 복제를 포함해야 함을 예측하는 포아송 분포(Poisson distribution)가 나타납니다(그림 9 참조). 따라서 낮은 복제수의 신뢰할 만한 검출을 위해서는 통계적 유의성을 제공하고 포아송 분포의 한계를 극복하기 위해 많은 수의 반복이 필요합니다.

그림 6.  PCR 효율의 정확한 계산은 희석 시리즈에 사용된 템플릿 양의 범위에 달려 있습니다. 5개 포인트(오렌지색)가 있는 2배 희석의 경우, 잠재적 아티팩트는 5개 포인트(파란색)가 있는 10배 희석보다 높습니다.

그림 7. 2개의 직선에 대하여 계산된 R² 값의 예. (A) x값과 y값 사이에 직접적인 관계가 있습니다. (B) x값과 y값 사이에 관계가 없습니다.

그림 8. 정규 분포와 표준 편차. (A) 데이터의 정규 분포가 표시됩니다. PCR 효율이 100%인 경우, 2배 희석 시리즈에서 두 개의 연속 샘플 평균의 C_t 차이는 1(시료 X 및 시료 Y)입니다. (B) 99.7%의 경우에서 두 샘플을 정량화할 수 있으려면 표준 편차가 1 C_t를 6 표준 편차(1/6 = 0.167)로 나눈 값보다 작아야 합니다. (C) 95%의 경우에서 두 샘플을 정량화할 수 있으려면 표준 편차가 1개 C_t를 4개 표준 편차(1/4 = 0.25)로 나눈 값보다 작아야 합니다.

그림 9. 낮은 복제 수의 포아송 분포(Poisson distribution). 파란색 곡선은 3.3pg의 DNA(DNA 복제 1개)에 대한 포아송 분포를 나타냅니다. 분홍색 곡선은 6.6pg의 DNA(1개 세포, DNA 복제 2개)에 대한 포아송 분포를 나타냅니다.

효율성, R², 정밀도 및 감도는 다양한 반응 조건을 비교할 때 PCR 반응의 성능을 결정하는데 사용됩니다. 엄격한 평가를 위해 표 1에 나열된 모든 요소를 함께 평가해야 합니다. 이러한 요소들 외에도 적절한 실험 제어(예: 템플릿 제어 없음, RT 제어 없음) 및 템플릿 품질을 평가하고 검증해야 합니다.