Real-Time PCR 필수 요소

실시간 중합효소 연쇄반응(PCR)은 발생하는(예: 실시간) PCR 프로세스를 모니터링하는 능력입니다. 따라서 PCR의 끝부분이 아닌 프로세스 전체에 걸쳐 데이터가 수집되므로 DNA와 RNA의 PCR 기반 정량에 있어 완전한 혁명을 일으킵니다. Real-Time PCR(qPCR)에서 반응은 사이클링 과정에서 고정된 횟수의 사이클 후에 축적된 타겟의 양보다는 타겟의 증폭이 처음 감지될 때의 시점으로 특징지어집니다. 핵산 타겟의 시작 복제 수가 많을수록 형광의 현저한 증가가 더 빨리 관찰됩니다. 반대로, 종말점 어세이("플레이트 판독 어세이"라고도 함)는 PCR 사이클의 끝부분에서 축적된 PCR 산물의 양을 측정합니다.

개요

당사는 서열 검출 시스템(SDS) 장비를 사용하여 PCR 산물을 검출하는 두 가지 유형의 화학 기술을 개발했습니다.

• Applied Biosystems™ TaqMan 화학("형광원성 5’ 뉴클레아제 화학"으로도 불림)
• Applied Biosystems™ SYBR™ Green I 염료 화학

TaqMan 화학 기술

TaqMan 화학 기술은 PCR 사이클 중에 축적되는 특정 PCR 산물의 검출을 위해 형광 프로브를 사용합니다.

TaqMan 화학 기술을 사용하는 어세이 유형

TaqMan 화학 기술은 다음 어세이 유형에 사용할 수 있습니다.
다음을 포함한 정량 분석

• RNA 정량 분석을 위한 1-스텝 RT-PCR
• RNA 정량 분석을 위한 2-스텝 RT-PCR
• DNA/cDNA 정량
  • 대립형질 변별
  • IPC를 이용한 플러스/마이너스

 SYBR Green I 염료 화학

SYBR Green I 염료 화학은 PCR 사이클 중에 축적되는 PCR 산물의 검출을 위해 특이도가 높은 이중 가닥 DNA 결합 염료인 Applied Biosystems™ SYBR™ Green I 염료를 사용합니다. TaqMan 및 SYBR Green I 염료 화학의 가장 중요한 차이점은 SYBR Green I 염료 화학 기술이 비특이적 반응 산물을 포함한 모든 이중 가닥 DNA를 검출한다는 것입니다. 따라서 정확한 결과를 얻으려면 정교하게 최적화된 반응이 필수적입니다.

SYBR Green I 염료 화학을 사용하는 어세이 유형

SYBR Green I 염료 화학은 다음 어세이 유형에 사용할 수 있습니다.

• RNA 정량 분석을 위한 1-스텝 RT-PCR
• RNA 정량 분석을 위한 2-스텝 RT-PCR
• DNA/cDNA 정량

TaqMan 화학 기술

배경

처음에는 Real-Time PCR(qPCR) 산물을 측정하는데 삽입제(intercalator) 염료를 사용하였습니다. 이 염료의 가장 큰 단점은 특이적 PCR 산물과 비특이적 PCR 산물 모두의 축적을 탐지한다는 것입니다.

TaqMan 화학 기술의 발전

PCR을 위한 실시간 시스템은 Taq DNA 중합효소의 5'뉴클레아제 활성을 이용하는 형광 표지 프로브의 도입으로 품질이 향상되었습니다. 이러한 형광 프로브의 사용으로 특정 증폭 산물만 검출하는 실시간 분석법을 개발할 수 있었습니다. 또한 형광 표지 프로브의 개발로 프로브 분해 분석을 위한 PCR 후공정(post-PCR processing)이 필요하지 않게 되었습니다.

TaqMan 서열 검출 화학의 작용 원리

TaqMan 화학 기술은 PCR 중에 축적되는 특정 PCR 산물의 검출을 위해 형광 프로브를 사용합니다. 작용 원리:

단계 프로세스

1. 올리고뉴클레오티드 프로브는 5' 말단에 리포터 형광 염료 및 3' 말단에 소광제 염료를 포함하도록 구성됩니다. 프로브가 손상되지 않으면서도 소광제 염료의 근접성으로 공간을 통한 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)에 의해 리포터 염료가 방출하는 형광이 크게 감소합니다.
2. 타겟 염기서열이 존재하는 경우, 프로브는 프라이머 부위 중 하나로부터 다운스트림으로 어닐링되며 이 프라이머가 연장됨에 따라 Taq DNA 중합효소의 5' 뉴클레아제 활성에 의해 분할됩니다.
3. 프로브의 이러한 분할은:
   • 리포터 염료 신호를 증가시키는 소광제 염료에서 리포터 염료를 분리합니다.
   • 프라이머가 템플릿 가닥의 말단까지 연장되도록 타겟 가닥에서 프로브를 제거합니다. 따라서 프로브의 포함이 전체 PCR 프로세스를 저해하지 않습니다.
4. 각 사이클마다 추가 리포터 염료 분자가 해당 프로브에서 분할되어 생성된 앰플리콘의 양에 비례하여 형광 강도가 증가합니다.

TaqMan 프로브의 두 가지 유형

당사는 두 가지 유형의 Applied Biosystems™ TaqMan 프로브를 제공합니다.

• TaqMan 프로브(Invitrogen™ TAMRA™ 염료를 소광제 염료로 사용)
• Applied Biosystems™ TaqMan MGB 프로브

대립형질 변별 어세이에 권장되는 TaqMan MGB 프로브

일반적으로 TaqMan MGB 프로브는 특히 기존 TaqMan 프로브가 30개 뉴클레오티드를 초과하는 경우에 대립형질 변별 어세이를 위해 사용할 것을 권장합니다. TaqMan MGB 프로브에는 다음 성분이 들어 있습니다.

• 3' 말단의 무형광 소광제—SDS 장비는 소광제가 형광을 나타내지 않기 때문에 리포터 염료의 기여도를 보다 정확하게 측정할 수 있습니다.
• 3' 말단의 MGB(minor groove binder)—MGB(minor groove binder)는 프로브의 용융 온도(Tm)를 증가시켜 보다 짧은 프로브를 사용할 수 있게 합니다.

따라서 TaqMan MGB 프로브는 일치하는 프로브와 일치하지 않는 프로브 사이의 Tm 값에 더 큰 차이를 나타내어 보다 정확한 대립형질 변별 기능을 제공합니다.

TaqMan 화학 기술의 장점

TaqMan 화학 기술의 장점은 다음과 같습니다.

• 형광 신호를 생성하려면 프로브와 타겟 사이의 특정한 부합법(hybridization)이 필요합니다.
• 프로브에 서로 다른 구별 가능한 리포터 염료를 라벨링할 수 있어 하나의 반응 튜브에서 두 개의 서로 다른 염기서열의 증폭이 가능합니다.
• PCR 후공정(post-PCR processing)이 필요하지 않아 어세이 인력 및 재료비가 절감됩니다.

TaqMan 화학 기술의 단점

TaqMan 화학 기술의 주요 단점은 상이한 염기서열에 대하여 각기 다른 프로브 합성이 필요하다는 것입니다.

배경

이중 가닥 DNA에 결합하는 소분자는 두 가지 등급으로 나눌 수 있습니다.

• 삽입제(intercalator)
• MGB(minor groove binder)

결합 방법에 관계없이 PCR의 실시간 검출을 위한 DNA 결합 염료에 대한 두 가지 요구사항이 있습니다.

• 이중 가닥 DNA에 결합시 형광 증가
• PCR 저해 없음

당사는 PCR을 저해하지 않고 SYBR Green I 염료를 사용할 수 있으며 브롬화 에티듐에 비해 검출 감도를 높일 수 있는 조건을 개발했습니다.

SYBR Green I 염료 화학의 작용 원리

SYBR Green I 염료 화학은 SYBR Green I 염료를 사용하여 PCR 동안 형성된 이중 가닥 DNA에 대한 결합을 통해 중합효소 연쇄반응(PCR) 산물을 검출합니다. 작용 원리:

단계 프로세스

SYBR Green I 염료를 샘플에 첨가하면 샘플에 존재하는 모든 이중 가닥 DNA에 즉시 결합합니다.

1. PCR 과정에서 pplied Biosystems™ AmpliTaq Gold™ DNA 중합효소는 PCR 산물 또는 "앰플리콘"을 생성하는 타겟 서열을 증폭시킵니다.
2. 그런 다음 SYBR Green I 염료가 이중 가닥 DNA의 각각의 새 복제본에 결합합니다.
3. PCR이 진행되면서 더 많은 앰플리콘이 생성됩니다. SYBR Green I 염료는 모든 이중 가닥 DNA에 결합하므로 생성된 PCR 산물의 양에 비례하여 형광 강도가 증가합니다.

SYBR Green I 염료의 장점

SYBR Green I 염료 화학의 장점은 다음과 같습니다.

• 모든 종류의 이중 가닥 DNA 염기서열의 증폭을 모니터링하는데 사용할 수 있습니다.
• 프로브가 필요하지 않아 어세이 설정 및 가동 비용이 절감됩니다.

SYBR Green I 염료의 단점

SYBR Green I 염료 화학의 주요 단점은 위양성 신호를 생성할 수 있다는 것입니다. 즉, SYBR Green I 염료가 모든 종류의 이중 가닥 DNA에 결합하기 때문에 비특이적인 이중 가닥 DNA 서열에도 결합할 수 있습니다.

추가 고려 사항

DNA 결합 염료 사용의 또다른 측면은 다수의 염료가 하나의 증폭된 분자에 결합할 수 있다는 것입니다. 이로 인해 증폭 산물의 검출 감도가 높아집니다. 다중 염료 결합의 결과는 신호의 양이 반응에서 생성된 이중 가닥 DNA의 질량에 따라 달라진다는 것입니다. 따라서 증폭 효율이 동일하다면 보다 긴 산물의 증폭이 보다 짧은 산물보다 더 많은 신호를 생성할 것입니다. 이는 길이에 관계없이 합성된 각 증폭 분자에 대해 단일 형광단이 소광으로부터 방출되는 형광 프로브를 사용할 때와 대조적입니다.

정량 분석이란 무엇인가?

정량 분석은 Real-Time PCR(qPCR) 어세이입니다. 이 어세이는 PCR의 각 증폭 사이클 동안 핵산 타겟의 양을 측정(정량)합니다. 타겟은 DNA, cDNA 또는 RNA일 수 있습니다. 이 화학 설명서에는 3가지 유형의 정량 분석이 설명되어 있습니다.

• DNA/cDNA 정량
• 1-스텝 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 이용한 RNA 정량
• 2-스텝 RT-PCR을 이용한 RNA 정량

정량 분석에 사용되는 용어

앰플리콘: PCR 과정에 의해 생성된 DNA의 짧은 부분
증폭 플롯(Amplication plot): 형광 신호 대 사이클 수의 플롯
기준선(baseline): 형광 신호의 변화가 거의 없는 PCR의 초기 사이클
Ct(역치 사이클): 형광이 고정된 임계 NTC를 통과하는 분획 수(템플릿 콘트롤 없음) - 템플릿을 포함하지 않는 샘플. 증폭 품질을 확인하는데 사용됩니다.
핵산 타겟: ("타겟 템플릿'이라고도 부름) - 증폭하고자 하는 DNA 또는 RNA 염기서열
패시브 참조물질(passive reference): 리포터 염료 신호가 데이터 분석 중에 정규화될 수 있도록 내부 기준을 제공하는 염료. 농도나 부피의 변화로 인해 발생하는 소실 변동을 교정하기 위해서는 정규화가 필요합니다. 패시브 참조 염료는 모든 SDS PCR 시약 키트에 포함되어 있습니다.
Rn(normalized reporter): 리포터 염료의 형광 방출 강도를 불활성 참조 염료의 형광 방출 강도로 나눈 값
Rn+: 템플릿을 포함한 모든 구성 요소를 포함하는 반응의 Rn 값
Rn-:미반응 샘플의 Rn 값. Rn 값은 다음에서 얻을 수 있습니다.

• Real-Time PCR(qPCR) 실행의 초기 사이클(검출 가능한 형광의 증가 이전의 사이클) 또는
• 템플릿이 포함되지 않은 반응

ΔRn(델타 Rn): 주어진 PCR 조건 세트에 의해 생성된 신호의 크기.
ΔRn 값은 다음 공식에 의해 결정됩니다. (Rn+) – (Rn-) 표준 곡선을 만드는데 사용되는 농도가 확인된 표준 A 샘플 다양한 농도의 표준물질을 실행하여 미확인 샘플의 양을 추정할 수 있는 표준 곡선을 만듭니다.
역치: 조정 가능한 요소를 곱한 초기 PCR 사이클의 Rn의 평균 표준 편차. 역치는 PCR 산물의 기하급수적인 증가와 관련된 영역에서 설정되어야 합니다.
미지(unknown): 양을 알 수 없는 템플릿을 포함하는 샘플. 이것이 양을 결정하고자 하는 시료입니다.

Real-Time PCR(qPCR) 정량 분석의 작용 원리

PCR의 초기 사이클에서는 형광 신호의 변화가 거의 없습니다. 이는 증폭 플롯의 기준선을 정의합니다. 기준선을 넘는 형광의 증가는 누적된 타겟의 검출을 의미합니다. 고정된 형광 역치는 기준선보다 높게 설정할 수 있습니다. 매개변수 CT(역치 사이클)는 형광이 고정된 역치를 통과하는 분획 사이클 수로 정의됩니다.

개요

정량 분석 결과를 계산할 때 절대 정량 또는 상대 정량을 사용할 수 있습니다.

절대 정량이란?

절대 정량은 표준 곡선에서 양을 보간(interpolate)하여 미확인 시료를 정량하는데 사용됩니다.

예

절대 정량은 질병 상태와 바이러스 복제 수의 상관 관계를 규명하는데 사용됩니다. 연구자는 질병의 진행 상태를 모니터링하기 위해 주어진 생물학적 샘플에서 타겟 RNA의 정확한 복제 수를 아는 것이 중요합니다. 절대 정량은 모든 SDS 장비의 데이터로 수행할 수 있지만 먼저 표준물질의 절대량이 독립적인 방법으로 확인되어야 합니다.

상대 정량이란?

상대 정량 분석은 다른 기준 샘플(예: 비처리 대조 샘플)과 비교하여 주어진 샘플의 유전자 발현 변화를 분석하는데 사용됩니다.

예

상대 정량은 화학 물질(약물)에 대한 반응으로 유전자 발현을 측정하는데 사용할 수 있습니다. 화학 처리된 샘플에서 특정 관심 유전자의 유전자 발현 수준을 미처리 샘플의 유전자 발현 수준과 비교합니다.

상대 정량을 위한 계산 방법

상대 정량은 모든 SDS 장비의 데이터로 수행할 수 있습니다. 상대 정량에 사용되는 계산 방법은 다음과 같습니다.

• 표준 곡선법
• Comparative CT법

사용할 방법 결정모든 방법에서 동일한 결과를 얻을 수 있습니다. 어떤 방법을 사용할 것인지 결정할 때 다음 사항에 유의하십시오.

• 개별 튜브에서 타겟 및 내생 대조군의 증폭을 실행하고 표준 곡선법을 사용하려면 최소한의 최적화 및 검증이 필요합니다.
• Comparative CT법을 사용하려면 타겟 및 내생 대조군의 증폭 효율이 거의 동일하다는 것을 보여주기 위해 검증 실험을 수행해야 합니다. Comparative CT법을 사용했을 때의 장점은 표준 곡선이 필요하지 않다는 것입니다. 이로 인해 표준 곡선 샘플을 위한 웰(well)이 더 이상 필요하지 않기 때문에 처리량이 증가합니다. 또한 표준 곡선 샘플을 만들 때 발생하는 희석 오류의 부정적인 영향을 제거합니다.
• 동일한 튜브에서 타겟 및 내생 대조군을 증폭시키려면 프라이머 농도를 제한하는 것이 확인되고 CT 값에 영향을 미치지 않음을 보여주어야 합니다. 동일한 튜브에서 두 개의 반응을 실행하여 처리량이 증가하고 피펫팅 오류의 영향이 줄어듭니다.

사용되는 용어

절대 및 상대 정량에 대해 다음 용어가 사용됩니다.

표준물질: 표준 곡선을 만드는데 사용되는 농도가 확인된 샘플.
참조(reference): 실험 결과를 정규화하는데 사용되는 패시브(passive) 또는 활성 신호. 내생 및 외생 대조군은 활성 참조 물질의 예입니다. 활성 참조 물질은 해당 신호가 PCR 증폭의 결과로 생성된 것임을 의미합니다. 활성 참조 물질은 자체 프라이머 및 프로브 세트를 가지고 있습니다.
내생 대조군: 분리된 각 실험 샘플에 존재하는 RNA 또는 DNA입니다. 내생 대조군을 활성 참조 물질로 사용하는 경우, 각 반응에 첨가된 총 RNA 양의 차이에 대한 메신저 RNA(mRNA) 타겟의 정량을 정규화할 수 있습니다.
외생 대조군: 농도가 확인된 샘플에 첨가된 특성화된 RNA 또는 DNA입니다. 외생 활성 참조 물질은 PCR 저해와 진성 타겟 음성을 구별하기 위해 내부 양성 대조군(IPC)으로 사용할 수 있는 체외(in vitro) 구조입니다. 외생 참조 물질은 또한 역전사 효소에 의한 상보적 DNA(cDNA) 합성 또는 샘플 추출의 효율 차이를 정규화하는데 사용될 수 있습니다. 외생 참조 물질의 사용 여부와 관계 없이 형광 신호의 비 PCR 관련 변동을 정규화하기 위해 염료 ROX가 포함된 패시브(passive) 참조 물질을 사용하는 것이 중요합니다.
정규화된 타겟의 양: 서로 다른 샘플의 상대적인 양을 비교하는데 사용할 수 있는 단위가 없는 숫자입니다.
캘리브레이터: 비교 결과의 기초로 사용되는 샘플입니다.

개요

정도관리물질과 같은 몇 가지 기본 시료를 기준으로 양을 표현하기 때문에 상대 정량화를 위한 표준 곡선을 쉽게 준비할 수 있습니다. 모든 실험 시료는 표준 곡선에서 타겟의 양을 결정하고 정도관리물질의 타겟 양으로 나눕니다. 따라서 정도관리물질은 1X 시료가 되고 다른 모든 수량은 정도관리물질과 비교하여 n배의 차이로 표시됩니다. 예를 들어, 약물이 발현에 미치는 영향에 대한 연구에서 미치료 대조군은 적절한 정도관리물질이 될 것입니다.

주요 가이드라인

아래의 가이드라인은 상대 정량화를 위한 표준 곡선 메서드(Method)의 적절한 사용을 위해 중요합니다.

• stock RNA 또는 DNA를 정확하게 희석하는 것이 중요하지만 이 희석을 표현하는 데 사용되는 단위는 부적합합니다. 대조군 세포주에서 총 RNA 전처리물을 2배 희석하여 표준 곡선을 만들면 단위는 희석 값 1, 0.5, 0.25, 0.125 등이 될 수 있습니다. 동일한 stock RNA 또는 DNA를 사용하여 여러 개의 플레이트에 대한 표준 곡선을 만들면 결정된 상대적인 양을 플레이트 간에 비교할 수 있습니다.
• RNA의 상대적 정량화를 위해 DNA 표준 곡선을 사용할 수 있습니다. 이를 위해서는 타겟의 역전사 효율이 모든 시료에서 동일하다는 가정이 필요하지만 이 효율의 정확한 값을 알 필요는 없습니다.
• 내생 제어 물질로 정규화된 정량의 경우 표준 곡선은 타겟 및 내생 기준 모두를 위해 준비됩니다. 각 실험 시료에 대해 타겟 및 내생 기준의 양을 적절한 표준 곡선에서 결정합니다. 그런 다음 타겟의 양을 내성 기준으로 나누어 정규화된 타겟 값을 얻습니다. 다시 말하자면 실험 시료 중 하나는 정도관리물질 또는 1× 시료입니다. 각각의 정규화된 타겟 값을 정도관리물질 정규화 타겟으로 나누어 상대적인 발현 수준을 생성합니다.

내생 제어 물질

내생 제어 물질의 증폭은 반응에 첨가된 시료 RNA 또는 DNA의 양을 표준화하기 위해 수행될 수 있습니다. 유전자 발현의 정량화를 위해 연구자들은 ß-actin, GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 리보솜 RNA(rRNA) 또는 기타 RNA를 내생 제어 물질로 사용했습니다.

표준물질

시료 양을 정도관리물질의 양으로 나누기 때문에 표준 곡선의 단위가 떨어집니다. 따라서 표준물질에 요구되는 모든 것은 상대적인 희석 수준을 밝히는 것입니다. 상대 정량화의 경우, 이는 표준물질을 준비하기 위해 적절한 타겟을 포함하고 있는 모든 stock RNA 또는 DNA를 사용할 수 있음을 의미합니다.

Comparative CT 메서드(Method)는 산술 공식인 2−^ΔΔC_T를 사용하여 상대 정량화를 위해 동일한 결과를 얻는 것을 제외하고는 표준 곡선 메서드(Method)와 비슷합니다.

산술 공식:

Comparative CT 메서드(Method)가 유효하기 위해서는 타겟 증폭 효율(관심 유전자)과 기준 증폭 효율(내생 제어 물질)이 거의 동일해야 합니다.
Comparative CT 메서드(Method)를 사용한 상대 정량화에 대한 자세한 내용은 사용자 공고 #2: 유전자 발현의 상대 정량화(PN 4303859)를 참조하십시오.

개요

절대 정량화를 위한 표준 곡선 메서드(Method)는 상대 정량화를 위한 표준 곡선 메서드(Method)와 유사하지만 먼저 표준물질의 절대량이 독립적인 방법으로 확인되어야 합니다.

주요 가이드라인

아래의 가이드라인은 절대 정량화를 위한 표준 곡선 메서드(Method)의 적절한 사용을 위해 중요합니다.

• DNA나 RNA가 순수한 단일 종인 것이 중요합니다. 예를 들어, 대장균으로부터 제조된 플라스미드 DNA는 종종 RNA로 오염되어 A260 측정치를 증가시키고 플라스미드에 대해 결정되는 복제 수를 늘립니다.
• 표준물질을 수십배 이상 희석해야 하기 때문에 정확한 피펫팅이 필요합니다. 정확한 A260 값을 측정하려면 플라스미드 DNA 또는 체외 전사 RNA가 농축되어야 합니다. 이 농축된 DNA 또는 RNA는 106-1012배로 희석하여 생물학적 시료의 타겟과 비슷한 농도가 되어야 합니다.
• 특히 RNA의 경우 희석된 표준물질의 안정성이 고려되어야 합니다. 희석된 표준 물질을 작은 분액으로 나누어 -80°C에서 보관하고 사용 전에 한 번만 해동합니다.

 역전사 단계의 효율성에 위한 통제가 없으므로 RNA의 절대 정량화를 위한 표준으로 DNA를 사용하는 것은 일반적으로 불가능합니다.

표준물질

먼저 표준물질의 절대량이 독립적인 방법으로 확인되어야 합니다. 플라스미드 DNA 및 체외 전사 RNA는 일반적으로 절대 표준을 준비하는데 사용됩니다. 농도는 A₂₆₀으로 측정하고 DNA 또는 RNA의 분자량을 사용하여 복제 수로 변환합니다.

PCR 프로세스 및 5' 뉴클레아제 프로세스는 Roche Molecular Systems, Inc. 및 F. Hoffmann-La Roche Ltd가 소유한 특허에 의해 보호됩니다. 

기타 모든 상표는 각 소유자의 자산입니다.