Real-Time PCR을 위한 TaqMan과 SYBR 화학 비교

배경

처음에는 Real-Time PCR 산물을 측정하는데 삽입제(intercalator) 염료를 사용하였습니다. 이 염료의 가장 큰 단점은 특이적 PCR 산물과 비특이적 PCR 산물 모두의 축적을 탐지한다는 것입니다.

TaqMan 화학의 발전

PCR을 위한 실시간 시스템은 Taq DNA 중합효소의 5' 뉴클레아제 활성을 이용하는 형광 표지 프로브의 도입으로 품질이 향상되었습니다. 이러한 형광 프로브의 사용으로 특정 증폭 산물만 검출하는 실시간 분석법을 개발할 수 있었습니다.

단계별 프로세스

TaqMan 프로브의 두 가지 유형

당사는 두 가지 유형의 Applied Biosystems™ TaqMan 프로브를 제공합니다.

• TaqMan 프로브(TAMRA™ 염료를 소광제 염료로 사용)
• TaqMan MGB 프로브

대립형질 변별 어세이에 권장되는 TaqMan MGB 프로브

일반적으로 TaqMan MGB 프로브는 특히 기존 TaqMan프로브가 30개 뉴클레오티드를 초과하는 경우에 대립형질 변별 어세이를 위해 사용할 것을 권장합니다. TaqMan MGB 프로브에는 다음 성분이 들어 있습니다.

• 3' 말단의 무형광 소광제—Real-Time PCR 장비는 소광제가 형광을 나타내지 않기 때문에 리포터 염료의 기여도를 보다 정확하게 측정할 수 있습니다.
• 3' 말단의 MGB(minor groove binder)—MGB(minor groove binder)는 프로브의 용융 온도(Tm)를 증가시켜 보다 짧은 프로브를 사용할 수 있게 합니다.

따라서 TaqMan MGB 프로브는 일치하는 프로브와 일치하지 않는 프로브 사이의 Tm 값에 더 큰 차이를 나타내어 보다 정확한 대립형질 변별 기능을 제공합니다.

TaqMan 화학의 장점

• 형광 신호를 생성하려면 프로브와 타겟 사이의 특정한 부합법(hybridization)이 필요합니다.
• 프로브에 서로 다른 구별 가능한 리포터 염료를 라벨링할 수 있어 하나의 반응 튜브에서 두 개의 서로 다른 염기서열의 증폭 및 검출이 가능합니다.
• PCR 후공정(post-PCR processing)이 필요하지 않아 어세이 인력 및 재료비가 절감됩니다.

TaqMan 화학의 단점

주요 단점은 상이한 염기서열에 대하여 각기 다른 프로브 합성이 필요하다는 것입니다.

배경

이중 가닥 DNA에 결합하는 소분자는 두 가지 등급으로 나눌 수 있습니다.

• 삽입제(intercalator)
• MGB(minor groove binder)

결합 방법에 관계없이 PCR의 실시간 검출을 위한 DNA 결합 염료에 대한 두 가지 요구사항이 있습니다.

• 이중 가닥 DNA에 결합 시 형광 증가
• PCR 저해 없음

당사는 PCR을 거의 저해하지 않고 SYBR 그린 I 염료를 사용할 수 있으며 브롬화 에티듐에 비해 검출 감도를 높일 수 있는 조건을 개발했습니다. 또한, 당사는 형광이 더 밝고 기존 SYBR 그린 I보다 PCR을 덜 저해하는 최신 SYBR 그린 염료를 보유하고 있습니다.

SYBR 염료 화학 작용 원리

SYBR 염료는 PCR 동안 형성된 이중 가닥 DNA에 결합하여 중합효소 연쇄반응(PCR) 산물을 검출합니다. 작용 원리:

단계별 프로세스

1. SYBR 염료를 시료에 첨가하면 샘플에 존재하는 모든 이중 가닥 DNA에 즉시 결합합니다.
2. PCR 과정에서 DNA 중합효소는 PCR 산물을 생성하는 타겟 염기서열을 증폭시킵니다.
3. 그런 다음 SYBR 염료가 이중 가닥 DNA의 각각의 새 복제본에 결합합니다.
4. PCR이 진행되면서 더 많은 PCR 산물이 생성됩니다. SYBR 염료는 모든 이중 가닥 DNA에 결합하므로 생성된 PCR 산물의 양에 비례하여 형광 강도가 증가합니다.

SYBR 염료의 장점

• 모든 종류의 이중 가닥 DNA 염기서열의 증폭을 모니터링하는데 사용할 수 있습니다.
• PCR 프라이머가 잘 디자인되어 있고 반응이 양호하게 특성화되어 있다고 가정할 때 프로브가 필요하지 않아 어세이 설정 및 가동 비용을 절감할 수 있습니다.

SYBR 염료의 단점

주요 단점은 위양성 신호를 생성할 수 있다는 것입니다. 즉, SYBR 염료가 모든 종류의 이중 가닥 DNA에 결합하기 때문에 비특이적인 이중 가닥 DNA 염기서열에도 결합할 수 있습니다. 따라서 비타겟 염기서열을 증폭시키지 않는 잘 디자인된 프라이머를 갖추는 것과 용융 곡선 분석을 수행하는 것이 매우 중요합니다.

추가 고려 사항

DNA 결합 염료 사용의 또다른 측면은 다수의 염료 분자가 하나의 증폭된 DNA 분자에 결합할 수 있다는 것입니다. 다중 염료 결합의 결과는 신호의 양이 반응에서 생성된 이중 가닥 DNA의 질량에 따라 달라진다는 것입니다. 따라서 증폭 효율이 동일하다면 보다 긴 산물의 증폭이 보다 짧은 산물보다 더 많은 신호를 생성할 것입니다. 이는 길이에 관계없이 합성된 각 증폭 분자에 대해 단일 형광단이 소광으로부터 방출되는 형광 프로브를 사용할 때와 대조적입니다.