TaqMan 어세이 원리

TaqMan 유전자 발현 어세이는 형광 프로브를 사용하여 PCR 과정에서 축적되는 특정 PCR 산물을 검출할 수 있는 5' 뉴클레아제 화학 기술을 기반으로 합니다.

각각의 어세이에는 다음 내용물이 포함됩니다.

• 한 쌍의 비표지 프라이머
• 5' 말단에 FAM™ 또는 VIC™ 염료 라벨이 붙어 있고 3' 말단에 MGB(minor groove binder) 및 무형광 소광제(NFQ)가 붙어 있는 TaqMan 프로브

아래 그림은 TaqMan 유전자 발현 어세이 프로세스를 보여줍니다.

1. Real-Time PCR을 시작할 때 온도가 상승하여 이중 가닥 cDNA를 변성시킵니다. 이 단계에서 TaqMan 프로브의 5' 말단에 있는 형광 염료의 신호가 3' 말단의 NFQ에 의해 퀜칭(quenching)됩니다.
2. 다음 단계에서는 프라이머와 프로브가 특정 타겟 서열에 어닐링될 수 있도록 반응 온도를 낮춥니다.
3. Taq DNA 중합효소는 비표지 프라이머와 템플릿을 사용하여 새로운 가닥을 합성합니다. 중합효소가 TaqMan 프로브에 도달하면 내생 5' 뉴클레아제 활성이 프로브를 분할하여 염료를 소광제(quencher)로부터 분리합니다.

PCR의 매 사이클마다 더 많은 염료 분자가 방출되어 합성되는 앰플리콘의 양에 비례하여 형광 강도가 증가합니다.

TaqMan MGB 프로브는 일치하는 프로브와 일치하지 않는 프로브 사이의 T_m 차이를 더 크게 만드는 Minor Groove Binding 모이어티를 포함합니다. 또한 TaqMan MGB 프로브에는 반응에 여러 가지 염료를 사용할 때 스펙트럼 분해능을 향상시키는 무형광 소광제가 포함되어 있습니다.

TaqMan 유전자 발현 어세이 ›

TaqMan 유전형 분석 어세이(TaqMan SNP 유전형 분석 어세이 및 TaqMan 약물 대사 유전형 분석 어세이)는 사전에 최적화된 PCR 프라이머 쌍과 대립형질 변별을 위한 두 개의 프로브로 구성됩니다.

각각의 어세이에는 다음 내용물이 포함됩니다.

• 한 쌍의 비표지 프라이머
• 5' 말단에 하나는 FAM 염료 라벨이 붙어 있고 하나는 VIC 염료 라벨이 붙어 있으며 3' 말단에 MGB(minor groove binder) 및 무형광 소광제(NFQ)가 붙어 있는 두 개의 TaqMan 프로브.

TaqMan 유전형 분석 어세이는 게놈 DNA(gDNA)의 특정 대립 유전자를 증폭 및 검출하는데 사용됩니다. 아래 그림은 TaqMan SNP 유전형 분석 어세이 프로세스를 보여줍니다.

1. 게놈 DNA는 TaqMan 유전형 분석 마스터 믹스, 정방향 및 역방향 프라이머 및 2개의 TaqMan MGB 프로브로 구성된 반응 혼합물에 주입됩니다.
2. 각각의 TaqMan MGB 프로브는 정방향 및 역방향 프라이머 부위 사이에 상보성 서열이 존재할 경우에 특이적으로 어닐링됩니다. 프로브가 손상되지 않으면서도 리포터 염료에 대한 소광제 염료의 근접성으로 리포터 형광이 억제됩니다.
3. AmpliTaq Gold DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성은 타겟에 혼합된 프로브만 분할합니다. 분할을 통해 소광제 염료에서 리포터 염료가 분리되므로, 이 리포터를 통해 형광이 증가합니다. 증폭된 타겟 서열이 프로브와 상보적인 경우에만 형광의 증가가 일어납니다. 따라서 PCR 증폭에 의해 생성된 형광 신호는 샘플에 어떤 대립 유전자가 있는지를 나타냅니다.

TaqMan SNP 유전형 분석 어세이 ›   TaqMan 약물 대사 유전형 분석 어세이 ›

TaqMan 복제 수(Copy Number) 어세이는 듀플렉스 실시간 중합효소 연쇄반응(PCR)에서 TaqMan 복제 수 참조 어세이(Copy Number Reference Assay)와 함께 실행됩니다. 이 복제 수 어세이는 타겟 유전자 또는 관심 게놈 서열을 검출하고 참조 어세이는 디플로이드 게놈(diploid genome)에서 2개의 카피(copy)로 존재하는 것으로 알려져 있는 서열을 검출합니다. 

PCR 과정에서:

a. TaqMan 복제 수 어세이, TaqMan 복제 수 참조 어세이, TaqMan 유전형 분석 마스터 믹스 및 gDNA 샘플이 단일 웰 또는 튜브에서 함께 혼합됩니다.

b. gDNA 템플릿이 변성되고 분석 프라이머의 각 세트는 그의 특정 타겟 서열에 어닐링됩니다. 각각의 TaqMan 프로브는 정방향 및 역방향 프라이머 부위 사이의 상보성 서열에 특이적으로 어닐링됩니다. 각각의 올리고뉴클레오티드 프로브가 손상되지 않으면서도 퀜칭되는 리포터 염료에 대한 소광제 염료의 근접성으로 리포터 형광이 억제됩니다.

c. PCR의 각 라운드 동안 AmpliTaq Gold DNA 중합효소를 사용하여 타겟 및 참조 서열이 동시에 증폭됩니다. 이 효소는 각 앰플리콘 서열에 혼합된 프로브를 분할하는 5' 뉴클레아제 활성을 갖습니다. 올리고뉴클레오티드 프로브가 AmpliTaq Gold DNA 중합효소 5′ 뉴클레아제 활성에 의해 분할될 때 소광체가 리포터 염료에서 분리되어 리포터의 형광을 증가시킵니다. PCR 산물의 축적은 각 PCR 사이클에서 각 리포터 염료의 형광 증가를 모니터링함으로써 실시간으로 검출할 수 있습니다.

이 상대 정량법은 참조 서열의 확인된 복제 수로 정규화된 gDNA 샘플에서 관심 타겟의 상대적인 복제 수를 측정하는데 사용됩니다.

TaqMan 복제 수 어세이 ›   복제 수 변이 지원  ›

TaqMan Advanced miRNA 어세이를 사용한 정량화에는 cDNA 합성 단계와 Real-Time PCR을 이용한 검출이 필요합니다.

TaqMan Advanced miRNA 어세이 워크플로우.

(A) cDNA 합성 워크플로우에는 3' 폴리(A) 첨가 및 5' 어댑터 라이게이션(ligation) 단계와 범용 RT 프라이머를 이용한 역전사가 통합되어 있습니다. 선택적 miR-Amp 반응을 수행하여 qPCR에 의한 검출 전에 miRNA cDNA를 균일하게 증가시킵니다.

(B) 각각의 TaqMan Advanced miRNA 어세이는 정방향 및 역방향 프라이머 부위 사이의 상보적 서열에 특이적으로 어닐링하는 TaqMan MGB(minor groove binder) 프로브를 사용합니다. MGB 변형은 프로브 길이를 늘리지 않고 용융 온도를 높이므로 보다 짧은 프로브를 설계할 수 있습니다. 프로브가 손상되지 않으면서도 무형광 소광제(NFQ)에 대한 리포터 염료의 근접성으로 리포터 형광이 억제됩니다. 프라이머 연장 중 DNA 중합효소에 의한 프로브 분할은 NFQ에서 리포터 염료를 분리하여 리포터의 형광을 증가시킵니다.

TaqMan Advanced miRNA 어세이 ›

TaqMan^® 돌연변이 검출 어세이는 대립 유전자 특이적 TaqMan qPCR과 대립 유전자 특이적 MGB 차단제 올리고뉴클레오티드를 결합하여 비타겟 대립 유전자의 비특이적 증폭을 효과적으로 억제하는 새로운 경쟁적 대립 유전자 특이적 TaqMan(castPCR™) 기술을 기반으로 합니다.

돌연변이 대립 유전자 어세이 또는 야생형 대립 유전자 어세이는 대립 유전자 특이적 프라이머(빨간색), 유전자좌 특이적 프라이머(보라색), 유전자좌 특이적 TaqMan 프로브(녹색) 및 대립 유전자 특이적 차단제(파란색)로 구성됩니다. 샘플에 존재하는 돌연변이의 수준은 돌연변이 대립 유전자 어세이 및 상응하는 야생형 대립 유전자 어세이 또는 돌연변이 대립 유전자 어세이 및 유전자 참조 어세이에 대한 ΔC_t에 기초하여 계산됩니다.

TaqMan 돌연변이 검출 어세이 ›

TaqMan^® 단백질 어세이는 Real-Time PCR을 통해 항체-단백질 결합과 리포터 핵산 검출을 결합한 근접 접합 어세이(PLA™)의 적응형 형태입니다.

TaqMan 단백질 어세이 워크플로우

TaqMan 단백질 어세이 ›