소개

Real-time PCR, 전통적 PCR 및 디지털 PCR 비교 보기

디지털 PCRReal-time PCR전통적 PCR
개요절대 복제 수를 측정하기 위해 음성 복제(negative replicates)의 비율을 측정합니다.PCR 증폭을 측정합니다.PCR 사이클의 끝부분에서 축적된 PCR 산물의 양을 측정합니다.
정량적인가?예, 음성 PCR 반응의 비율은 포아송(Poisson) 통계 알고리즘에 적합합니다.예, 이는 PCR 산물의 양이 템플릿 핵산의 양에 직접 비례할 때 PCR의 익스포넨셜 성장(로그) 단계 동안 데이터가 수집되기 때문입니다.아니오. 겔에서 증폭된 밴드의 강도를 확인된 농도의 표준물질과 비교하면 '반정량적(semi-quantitative)' 결과를 얻을 수 있습니다.
애플리케이션
  • 바이러스 양의 절대 정량
  • 핵산 표준물질의 절대 정량
  • 차세대 염기서열분석 라이브러리의 절대 정량
  • 희귀 대립 유전자 검출
  • 유전자 발현의 절대 정량
  • 혼합물의 농축 및 분리
  • 유전자 발현의 정량 분석
  • 마이크로어레이 검증
  • 품질 관리 및 어세이 검증
  • 병원균 검출
  • SNP 유전형 분석
  • 복제 수 변이
  • microRNA 분석
  • 바이러스 정량
  • siRNA/RNAi 실험

다음 분석을 위한 DNA 증폭:

  • 염기서열분석
  • 유전형 분석
  • 클로닝
요약

디지털 PCR의 장점:

  • 참조 또는 표준 물질에 의존할 필요 없음
  • PCR 반복의 총 횟수를 늘림으로써 원하는 정밀도를 달성할 수 있음
  • 저해제에 높은 내성
  • 복잡한 혼합물을 분석할 수 있음
  • 전통적 qPCR과 달리 디지털 PCR은 존재하는 복제 수에 대한 선형 반응을 제공하여 소규모 변화의 차이를 검출할 수 있음

Real-Time PCR의 장점:

  • 검출의 동적 범위 증가
  • PCR 후공정이 필요하지 않음
  • 2배 변화까지 검출할 수 있음
  • PCR의 익스포넨셜 성장 단계에서 데이터 수집
  • 리포터 형광 신호의 증가치는 생성된 앰플리콘의 수에 직접적으로 비례
  • 분할된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭 제공

전통적 PCR의 단점:

  • 낮은 정밀도
  • 낮은 감도
  • 2로그 미만의 짧은 동적 범위
  • 낮은 분해능
  • 비자동화
  • 크기에 따른 변별만 가능
  • 결과가 수치로 표현되지 않음
  • 염색에 사용되는 브롬화 에티듐이 매우 정량적이지 않음
  • PCR 후공정이 필요함

 전통적 PCR에 한계가 있는 이유를 이해하려면 PCR 반응 중에 어떤 일이 일어나는지 이해하는 것이 중요합니다. 기본 PCR 실행은 3가지 단계로 나눌 수 있습니다.

익스포넨셜(exponential)

매 사이클마다 산물의 축적량이 정확히 두 배가 됩니다(100% 반응 효율 가정). 반응이 매우 특이적이고 정밀합니다. 익스포넨셜 증폭은 모든 시약이 신선하고 이용 가능하기 때문에 발생하며, 반응 카이네틱스(kinetics)는 반응을 증폭시켜 증폭물의 배가를 돕습니다.

선형(linear, 높은 변동성)

반응이 진행되면서 일부 시약은 증폭의 결과로 소비됩니다. 반응이 느려지기 시작하고 PCR 산물은 더 이상 각 사이클마다 두 배가 되지 않습니다.

플래토(Plateau, 종말점: 전통적 방식의 겔 검출)

반응이 멈추고, 더 이상의 산물이 생성되지 않으며, 충분히 오래 두면 PCR 산물이 분해되기 시작합니다. 각각의 튜브 또는 반응은 각 샘플에 대한 반응 속도가 다르기 때문에 각기 다른 지점에서 플래토(plateau) 상태가 됩니다. 이러한 차이는 플래토(plateau) 단계에서 볼 수 있습니다. 전통적 PCR에서 측정치를 구하는 플래토(plateau) 단계는 종말점 검출로도 불립니다.

 그림 1: PCR 단계.

전통적 PCR은 플래토(plateau)에서 측정하여 가변적인 결과를 제공합니다.

그림 2에서 반응 초기에 동일한 양의 DNA를 갖는 3개의 반복(replicate) 샘플은 (반응 카이네틱스의 변화로 인해) 반응의 플래토 단계에 의해 각기 다른 양의 PCR 산물을 갖습니다. 따라서 반복 샘플이 기하급수적으로 증폭되는 익스포넨셜 단계에서 측정하는 것이 더 정확할 것입니다.

그림 2: 동일한 샘플이 PCR의 플래토 단계에 의해 각기 다른 양의 반응 산물을 생성합니다.

보다 정확한 정량화를 위해 익스포넨셜 단계에서 Real-Time PCR을 측정합니다.

익스포넨셜 단계가 정량화를 위해 가장 정밀하고 정확한 데이터를 제공하기 때문에 Real-Time PCR은 익스포넨셜 단계에 초점을 맞춥니다. 익스포넨셜 단계 내에서 Real-Time PCR 장비는 두 가지 값을 계산합니다. 역치선(threshold line)은 반응이 백그라운드 위의 형광 강도에 도달하는 검출 수준입니다. 샘플이 이 수준에 도달하는 PCR 사이클을 사이클 역치(Ct)라고 합니다. Ct 값은 다운스트림 정량 분석 또는 존재/부재 검출에 사용됩니다. 농도가 미확인된 샘플의 Ct 값을 일련의 표준물질과 비교하여 미확인 반응에서 템플릿 DNA의 양을 정확하게 결정할 수 있습니다.

그림 3: 샘플이 백그라운드 위의 형광 강도에 도달하는 지점을 사이클 역치(Ct)라고 합니다.

디지털 PCR은 절대 정량을 위해 개별 분자를 셉니다.

디지털 PCR은 샘플을 여러 개의 개별 Real-Time PCR 반응으로 분할하여 작용합니다. 이러한 반응의 일부는 타겟 분자를 포함하거나(양성) 포함하지 않습니다(음성). PCR 분석 이후 음성 반응 부분은 표준물질에 대한 참조나 내생 대조 물질 없이 샘플의 타겟 분자 수의 절대 개수를 생성하는데 사용됩니다.

그림 4:  디지털 PCR은 양성(검은색)과 음성(흰색) PCR 반응의 비율을 사용하여 타겟 분자의 수를 계산합니다.

Applied Biosystems TaqMan 프로브 및 SYBR 그린 기반 검출

모든 Real-Time PCR 반응에는 PCR 리포터 분자(예: Applied Biosystems™ TaqMan 프로브 또는 SYBR™ 그린 염료)가 들어 있어 PCR 산물의 축적을 모니터링합니다. 타겟 앰플리콘의 양이 증가함에 따라 형광단에서 방출되는 형광의 양도 증가합니다.

그림 5:  Real-Time PCR 및 전통적 PCR의 장점 비교

Applied Biosystems는 일상적이고 까다로운 응용 분야에 사용할 수 있는 모든 종류의 Real-Time PCR 제품을 보유하고 있습니다.

Applied Biosystems는 규격화된 유전자 특이적 프로브 및 프라이머 세트부터 일상적인 시약 및 플라스틱 제품, 기기 시스템, 소프트웨어 및 그 사이의 모든 것에 이르기까지 Real-Time PCR 기반 유전자 발현, miRNA, 복제 수 변이 및 SNP 유전형 분석을 위한 포괄적인 제품 세트를 제공합니다.

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.