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CRISPR 敲入编辑和基因标记 |
轻松构建适用于基因标记的即用型转染供体 DNA
Invitrogen 设计工具和试剂为使用 CRISPR-Cas9 或 TALEN 技术的荧光标记、表位标记或精确基因编辑实验构建供体 DNA 提供了一种快速简便的方法。与竞争对手的产品相比，Invitrogen TrueTag 供体 DNA 试剂盒可提高基因编辑效率，显著缩短方案时间，因为该试剂盒无需克隆步骤。该试剂盒随附了用于制备供体 DNA 的所有必需试剂和易于遵循的实验方案，可确保即使是新手也可以在自己的实验室中成功进行敲入实验。
- 高达 100% 的细胞编辑效率—无论是新手还是专业人员，都可以获得出色结果
- 无需克隆步骤—一步 PCR 法可以让您在几小时而不是几天内获得供体
- 缩短筛选时间—使用杀稻瘟菌素或嘌呤霉素，仅富集基因编辑细胞
- 轻松标记基因—在感兴趣的蛋白中添加您选择的荧光或表位标记
- 构建敲除细胞系—结合使用功能性敲除和荧光与选择标记，富集基因编辑细胞
对于小插入/缺失（多达 30 个碱基），我们建议使用 Invitrogen TrueDesign 基因组编辑器。使用此款免费在线软件可以设计和订购 CRISPR gRNA 和 ssDNA 供体，进行多达 30 个碱基的插入、缺失和替换。
| 基因组编辑类型 | TrueDesign 基因组编辑器 | TrueTag 供体 DNA 试剂盒 |
|---|---|---|
| ≤30 nt 的 SNP 编辑或其他取代 |  | |
| ≤30 nt 的缺失或插入 | | |
| 插入终止密码子进行功能性敲除 | | |
| 插入终止密码子、荧光标记和筛选标记进行编辑细胞的敲除和富集 | | |
| 荧光或表位基因标记 | | |
TALEN 或 CRISPR 敲入实验的 TrueTag 供体 DNA 试剂盒选择指南
使用 TrueTag DNA 供体试剂盒得到的基因标记样本数据
数据：在内源性蛋白的 C 端或 N 端添加荧光标记
TrueTag 供体 DNA 试剂盒有 4 种荧光标记（EmGFP、tagRFP、tagBFP、tagYFP）供选择，可直接构建报告基因细胞系，以了解蛋白质定位。标记可以添加到内源基因的 N 端或 C 端，包括用于富集编辑细胞的选择标记。
图 1.TrueTag 敲入 U2OS 细胞。使用 TrueCut Cas9 v2，一种 TrueTag dsDNA 供体转染 U2OS 细胞，在 ACTB 位点的 N 端或 C 端进行同源定向修复 (HDR)，以插入 GFP，并在 ACTB 的 N 端或 C 端插入 TrueGuide gRNA。使用 Lipofectamine CRISPRMAX 试剂进行转染。转染 7 天后，使用 NucBlue Live ReadyProbes 试剂进行细胞复染，并使用 EVOS FL 彩色成像系统捕获图像。
数据：U2OS 细胞中 ACTB 的表位标记
表位标记使用表位标记特异性单克隆抗体进行检测和纯化。进行表位标记对于无法获得可靠抗体的新型蛋白质或靶点来说非常有用。TrueTag 供体 DNA 试剂盒提供表达人流感病毒血凝素 (HA)、c-Myc 衍生蛋白 (Myc)、多组氨酸 (6xHis) 和 FLAG 八肽 DYKDDDDK (DDK) 的标记。
图 2.U2OS 细胞中 ACTB 的表位标记。用于人 β-actin 基因 C 末端标记的 gRNA 和接头引物由 TrueDesign Genome Editor 设计，供体 DNA 使用 TrueTag Donor DNAKit, HA 制备。使用含有嘌呤霉素或 杀稻瘟菌素 选择性标记的 C-3xHA 供体 DNA 模板，通过一步 PCR 法制备供体 DNA。使用 Lipofectamine CRISPRMAX Cas9 转染试剂，在 24 孔板中，将所得 PCR 产物 (500 ng) 与 TrueCut Cas9 蛋白 v2/gRNA (RNP) 复合物 (500 ng Cas9/125 ng sgRNA) 一起递送至 2 × 105 个 U2OS 细胞中。转染后 48 小时，将细胞分成 1:4，然后用 0、0.75 μg/ml 或 1 μg/ml 嘌呤霉素或 0、8 μg/ml 或 12 μg/ml 杀稻瘟菌素 处理 5-7 天。(A) 在抗生素选择后，将细胞等份接种到载玻片上，用 4% 多聚甲醛固定，用 0.1% Triton X-100 透化，然后用 HA 标记单克隆抗体 (2-2.2.14) DyLight 488 染色。使用 Texas Red-X 鬼笔环肽和 NucBlue Live ReadyProbes 试剂标记细胞骨架和细胞核。然后使用 Thermo Scientific CellInsight CX7 高内涵分析 (HCA) 平台进行细胞成像。 (B) 在 6 孔板中扩增后，收获细胞并在补充有蛋白酶抑制剂混合物的大约 100 µl Pierce IP 裂解缓冲液中进行裂解。使用 NuPAGE 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶分析 20 μL 等份上清液。将未转染的 细胞裂解物用作阴性对照。使用 iBlot 2 凝胶转印装置，将分离蛋白转印至硝化纤维膜上。将膜封闭 30 至 60 分钟，然后与 1:1,000 稀释的 HA 标记单克隆抗体 (2-2.2.14) 一起孵育过夜。洗涤后，将膜与 HRP 偶联的山羊抗小鼠二抗在 1:2,000 稀释度下孵育 30-60 分钟。充分洗涤后，膜用 SuperSignal West Dura 持久性底物显影，用 iBright 成像。使用抗 GAPDH 抗体作为上样对照。
数据：将 RFP 与 GFP 标记结合使用，以追踪同一细胞系中的两种蛋白
图 3.使用 GFP 和 RFP 双重标记 HEK293 细胞。使用 TrueCut Cas9 蛋白 v2（一种 TrueTag dsDNA 供体）转染 293FT 细胞，在 HIST1H4C 位点的 C 端进行同源定向修复 (HDR)，以插入 GFP-嘌呤霉素，然后额外再使用一个 TrueTag dsDNA 供体进行 HDR，以在 ACTB 位点的 N 端插入杀稻瘟菌素-RFP，并使用 TrueGuide 合成 gRNA 靶向每个基因组位点。使用 Lipofectamine CRISPRMAX 试剂进行转染。对 293FT 细胞施加选择性压力得到稳定的细胞系：首先进行 5 天的杀稻瘟菌素选择，然后进行 5 天的嘌呤霉素选择。使用 NucBlue Live ReadyProbes 试剂进行细胞复染，并使用 EVOS FL 彩色成像系统捕获图像。
将供体 DNA 制备时间从几天缩短至几小时，无需任何克隆步骤
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图 4.TrueTag 供体 DNA 试剂盒工作流程与竞争对手的同源重组敲入工作流程的比较。TrueTag 工作流程仅需数小时完成，就像完成一次 PCR 分析一样简单，只需柱纯化双链 DNA 产物，然后转染供体（使用适当的 CRISPR-Cas9 或 TAL 效应子核酸酶）即可敲入至您感兴趣的基因中。相反，竞争对手的试剂盒需要多个引物设计和 PCR 步骤，以将供体分子组装成骨架载体，然后再进行亚克隆。需要额外对大肠杆菌菌落进行筛选并进行序列验证。整个过程需要几天的时间才能完成。TrueTag 系统可在短短几个小时内生成供体分子。
C 端基因标记工作流程
图 5.使用 TrueTag 供体 DNA 试剂盒进行 C 端基因标记的工作流程概述。
数据：使用 GFP 标记生成稳定的 CRISPR 敲入细胞系
使用所有 TrueTag 供体 DNA 模板中包含的选择标记，可以更轻松地构建稳定的标记细胞系。使用杀稻瘟菌素或嘌呤霉素施加选择性压力（图 6），成功生成 >99% 的细胞表达 GFP 标记的细胞群。
图 6.10 天内生成稳定细胞系。第 1 天，使用 TrueCut Cas9 v2（一种 TrueTag dsDNA 供体）转染 293FT 细胞，在 ACTB 位点的 C 端进行同源定向修复，以插入 GFP-嘌呤霉素，并使用 Lipofectamine CRISPRMAX 试剂，在 ACTB 的 C 端插入 TrueGuide gRNA。TrueTag 供体生成速度快，仅需 3 小时或更短时间即可完成。第 3 天或第 4 天，同源性定向修复完成，融合标记从天然位点中表达出来。在本例中，约 25% 的细胞呈 GFP 阳性。可在转染后 72-96 小时开始选择。第 10 天，使用嘌呤霉素选择的稳定细胞群 >99% 呈 GFP 表达阳性。使用 Attune NxT 流式细胞仪收集数据。
数据：标记的 iPSC 细胞在分化为星形胶质细胞后表达 GFP 标记
胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 是一种 III 型中间丝蛋白，在中枢神经系统发育过程中由多种细胞类型（包括星形胶质细胞）表达。使用 TrueTag GFP Stem 试剂盒，iPS 细胞的 GFAP 基因被标记，使用选择标记富集，并分化为星形胶质细胞。分化后，TrueTag 敲入表达 GFAP 蛋白 GFP 标记。
图 7.GFAP 和 iPSC 向星形胶质细胞分化的稳定 GFP 标记。在 iPSC 细胞中，使用 TrueTag 供体 DNA 试剂盒 GFP Stem 在内源性 GFAP 基因的 C 端标记 EmGFP。然后使用 PSC 神经诱导培养基对所得 GFAP-EmGFP iPSC 报告细胞系进行 PSC 神经诱导。随后，使用星形胶质细胞分化培养基将所得 PSC 分化为星形胶质细胞。(A) 在分化的第 18 天左右检测到少量 GFP 阳性细胞，大多数细胞在第 45 天时为 GFP 阳性。(B) 为了确认 GFP 信号由 GFAP 基因表达驱动，将细胞用与 eFluor 570 偶联的抗 GFAP 抗体染色。红色染色确认 GFAP 表达与 GFP 重叠，表明 GFP 信号是由于星形胶质细胞中的 GFAP 蛋白表达所致。
数据：使用双富集荧光标记策略，在仅 10 天内即可获得 100% 敲除的细胞群
图 8.使用 FACS 分选和双重选择有效富集 HPRT 敲除的细胞。（上图）用 Cas9 RNP 和各 250 ng 靶向人 HPRT 基因的 GFP-Bsd 和 RFP-Puro 供体 DNA 转染 HEK293FT 细胞。 使用 TrueTag 敲除富集供体 DNA 试剂盒制备供体。转染后 48 小时，用 0.5 μg/ml 嘌呤霉素和 16 μg/ml 杀稻瘟菌素 选择转染的细胞 10 天，以清除未整合细胞群。通过流式细胞术分析测定 GFP+ 和 RFP+ 阳性细胞的百分比。使用细胞分选仪富集 GFS/RFP 双阳性细胞。与亲代细胞对照相比，分选细胞中有 >80% 为 GFP+ 和 RFP+ 细胞。（下图）免疫印迹结果表明了经不同嘌呤霉素/杀稻瘟菌素处理和分选/未分选细胞群的 HPRT 敲除情况。在 3 组条件下，与亲代细胞对照（阴性）相比，富集细胞达到 100% 的 HPRT 敲除。
TrueTag 敲除富集供体 DNA 试剂盒工作流程
图 9.使用 TrueTag 敲除富集供体 DNA 试剂盒进行敲除富集的工作流程概述。
数据：在内源性蛋白的 C 端或 N 端添加荧光标记
TrueTag 供体 DNA 试剂盒有 4 种荧光标记（EmGFP、tagRFP、tagBFP、tagYFP）供选择，可直接构建报告基因细胞系，以了解蛋白质定位。标记可以添加到内源基因的 N 端或 C 端，包括用于富集编辑细胞的选择标记。
图 1.TrueTag 敲入 U2OS 细胞。使用 TrueCut Cas9 v2，一种 TrueTag dsDNA 供体转染 U2OS 细胞，在 ACTB 位点的 N 端或 C 端进行同源定向修复 (HDR)，以插入 GFP，并在 ACTB 的 N 端或 C 端插入 TrueGuide gRNA。使用 Lipofectamine CRISPRMAX 试剂进行转染。转染 7 天后，使用 NucBlue Live ReadyProbes 试剂进行细胞复染，并使用 EVOS FL 彩色成像系统捕获图像。
数据：U2OS 细胞中 ACTB 的表位标记
表位标记使用表位标记特异性单克隆抗体进行检测和纯化。进行表位标记对于无法获得可靠抗体的新型蛋白质或靶点来说非常有用。TrueTag 供体 DNA 试剂盒提供表达人流感病毒血凝素 (HA)、c-Myc 衍生蛋白 (Myc)、多组氨酸 (6xHis) 和 FLAG 八肽 DYKDDDDK (DDK) 的标记。
图 2.U2OS 细胞中 ACTB 的表位标记。用于人 β-actin 基因 C 末端标记的 gRNA 和接头引物由 TrueDesign Genome Editor 设计，供体 DNA 使用 TrueTag Donor DNAKit, HA 制备。使用含有嘌呤霉素或 杀稻瘟菌素 选择性标记的 C-3xHA 供体 DNA 模板，通过一步 PCR 法制备供体 DNA。使用 Lipofectamine CRISPRMAX Cas9 转染试剂，在 24 孔板中，将所得 PCR 产物 (500 ng) 与 TrueCut Cas9 蛋白 v2/gRNA (RNP) 复合物 (500 ng Cas9/125 ng sgRNA) 一起递送至 2 × 105 个 U2OS 细胞中。转染后 48 小时，将细胞分成 1:4，然后用 0、0.75 μg/ml 或 1 μg/ml 嘌呤霉素或 0、8 μg/ml 或 12 μg/ml 杀稻瘟菌素 处理 5-7 天。(A) 在抗生素选择后，将细胞等份接种到载玻片上，用 4% 多聚甲醛固定，用 0.1% Triton X-100 透化，然后用 HA 标记单克隆抗体 (2-2.2.14) DyLight 488 染色。使用 Texas Red-X 鬼笔环肽和 NucBlue Live ReadyProbes 试剂标记细胞骨架和细胞核。然后使用 Thermo Scientific CellInsight CX7 高内涵分析 (HCA) 平台进行细胞成像。 (B) 在 6 孔板中扩增后，收获细胞并在补充有蛋白酶抑制剂混合物的大约 100 µl Pierce IP 裂解缓冲液中进行裂解。使用 NuPAGE 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶分析 20 μL 等份上清液。将未转染的 细胞裂解物用作阴性对照。使用 iBlot 2 凝胶转印装置，将分离蛋白转印至硝化纤维膜上。将膜封闭 30 至 60 分钟，然后与 1:1,000 稀释的 HA 标记单克隆抗体 (2-2.2.14) 一起孵育过夜。洗涤后，将膜与 HRP 偶联的山羊抗小鼠二抗在 1:2,000 稀释度下孵育 30-60 分钟。充分洗涤后，膜用 SuperSignal West Dura 持久性底物显影，用 iBright 成像。使用抗 GAPDH 抗体作为上样对照。
数据：将 RFP 与 GFP 标记结合使用，以追踪同一细胞系中的两种蛋白
图 3.使用 GFP 和 RFP 双重标记 HEK293 细胞。使用 TrueCut Cas9 蛋白 v2（一种 TrueTag dsDNA 供体）转染 293FT 细胞，在 HIST1H4C 位点的 C 端进行同源定向修复 (HDR)，以插入 GFP-嘌呤霉素，然后额外再使用一个 TrueTag dsDNA 供体进行 HDR，以在 ACTB 位点的 N 端插入杀稻瘟菌素-RFP，并使用 TrueGuide 合成 gRNA 靶向每个基因组位点。使用 Lipofectamine CRISPRMAX 试剂进行转染。对 293FT 细胞施加选择性压力得到稳定的细胞系：首先进行 5 天的杀稻瘟菌素选择，然后进行 5 天的嘌呤霉素选择。使用 NucBlue Live ReadyProbes 试剂进行细胞复染，并使用 EVOS FL 彩色成像系统捕获图像。
将供体 DNA 制备时间从几天缩短至几小时，无需任何克隆步骤
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图 4.TrueTag 供体 DNA 试剂盒工作流程与竞争对手的同源重组敲入工作流程的比较。TrueTag 工作流程仅需数小时完成，就像完成一次 PCR 分析一样简单，只需柱纯化双链 DNA 产物，然后转染供体（使用适当的 CRISPR-Cas9 或 TAL 效应子核酸酶）即可敲入至您感兴趣的基因中。相反，竞争对手的试剂盒需要多个引物设计和 PCR 步骤，以将供体分子组装成骨架载体，然后再进行亚克隆。需要额外对大肠杆菌菌落进行筛选并进行序列验证。整个过程需要几天的时间才能完成。TrueTag 系统可在短短几个小时内生成供体分子。
C 端基因标记工作流程
图 5.使用 TrueTag 供体 DNA 试剂盒进行 C 端基因标记的工作流程概述。
数据：使用 GFP 标记生成稳定的 CRISPR 敲入细胞系
使用所有 TrueTag 供体 DNA 模板中包含的选择标记，可以更轻松地构建稳定的标记细胞系。使用杀稻瘟菌素或嘌呤霉素施加选择性压力（图 6），成功生成 >99% 的细胞表达 GFP 标记的细胞群。
图 6.10 天内生成稳定细胞系。第 1 天，使用 TrueCut Cas9 v2（一种 TrueTag dsDNA 供体）转染 293FT 细胞，在 ACTB 位点的 C 端进行同源定向修复，以插入 GFP-嘌呤霉素，并使用 Lipofectamine CRISPRMAX 试剂，在 ACTB 的 C 端插入 TrueGuide gRNA。TrueTag 供体生成速度快，仅需 3 小时或更短时间即可完成。第 3 天或第 4 天，同源性定向修复完成，融合标记从天然位点中表达出来。在本例中，约 25% 的细胞呈 GFP 阳性。可在转染后 72-96 小时开始选择。第 10 天，使用嘌呤霉素选择的稳定细胞群 >99% 呈 GFP 表达阳性。使用 Attune NxT 流式细胞仪收集数据。
数据：标记的 iPSC 细胞在分化为星形胶质细胞后表达 GFP 标记
胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 是一种 III 型中间丝蛋白，在中枢神经系统发育过程中由多种细胞类型（包括星形胶质细胞）表达。使用 TrueTag GFP Stem 试剂盒，iPS 细胞的 GFAP 基因被标记，使用选择标记富集，并分化为星形胶质细胞。分化后，TrueTag 敲入表达 GFAP 蛋白 GFP 标记。
图 7.GFAP 和 iPSC 向星形胶质细胞分化的稳定 GFP 标记。在 iPSC 细胞中，使用 TrueTag 供体 DNA 试剂盒 GFP Stem 在内源性 GFAP 基因的 C 端标记 EmGFP。然后使用 PSC 神经诱导培养基对所得 GFAP-EmGFP iPSC 报告细胞系进行 PSC 神经诱导。随后，使用星形胶质细胞分化培养基将所得 PSC 分化为星形胶质细胞。(A) 在分化的第 18 天左右检测到少量 GFP 阳性细胞，大多数细胞在第 45 天时为 GFP 阳性。(B) 为了确认 GFP 信号由 GFAP 基因表达驱动，将细胞用与 eFluor 570 偶联的抗 GFAP 抗体染色。红色染色确认 GFAP 表达与 GFP 重叠，表明 GFP 信号是由于星形胶质细胞中的 GFAP 蛋白表达所致。
数据：使用双富集荧光标记策略，在仅 10 天内即可获得 100% 敲除的细胞群
图 8.使用 FACS 分选和双重选择有效富集 HPRT 敲除的细胞。（上图）用 Cas9 RNP 和各 250 ng 靶向人 HPRT 基因的 GFP-Bsd 和 RFP-Puro 供体 DNA 转染 HEK293FT 细胞。 使用 TrueTag 敲除富集供体 DNA 试剂盒制备供体。转染后 48 小时，用 0.5 μg/ml 嘌呤霉素和 16 μg/ml 杀稻瘟菌素 选择转染的细胞 10 天，以清除未整合细胞群。通过流式细胞术分析测定 GFP+ 和 RFP+ 阳性细胞的百分比。使用细胞分选仪富集 GFS/RFP 双阳性细胞。与亲代细胞对照相比，分选细胞中有 >80% 为 GFP+ 和 RFP+ 细胞。（下图）免疫印迹结果表明了经不同嘌呤霉素/杀稻瘟菌素处理和分选/未分选细胞群的 HPRT 敲除情况。在 3 组条件下，与亲代细胞对照（阴性）相比，富集细胞达到 100% 的 HPRT 敲除。
TrueTag 敲除富集供体 DNA 试剂盒工作流程
图 9.使用 TrueTag 敲除富集供体 DNA 试剂盒进行敲除富集的工作流程概述。
TrueTag 供体 DNA 试剂盒 FAQ
生成供体 DNA 构建体所需的分子生物学技术知识很少。除 TrueTag 试剂盒提供的模板、PCR 必需品和纯化试剂之外，TrueDesign Genome Editor 软件能够让您通过简单直接的界面完成每一个设计步骤。该软件将在几分钟内生成所需的 CRISPR 向导 RNA、具有同源臂的扩增引物和验证引物，并具有方便的添加到购物车功能。
可以，TrueTag 系统提供 4 种不同的荧光标记（GFP、RFP、BFP 或 YFP），可与最常见的荧光滤光片组结合使用。其也允许同时标记和观察不同的蛋白质。
TrueTag 干细胞试剂盒专为此类实验设计。选择标记由其自身启动子驱动，因此可在不存在内源基因表达的情况下进行富集，也可以驱动荧光标记的表达。
您需要根据实验的预期结果确定转录本。如果您想要敲除所有已知的等位基因，你需要在转录本中选择一个所有剪接变体共有的区域。如果您只想敲除特定变体，您需要选择对应转录本独有的区域。TrueDesign 软件直接链接至 NCBI，轻松访问最新版转录本拓扑，以帮助您作出决定。
KO 富集试剂盒旨在解决这个问题。通过结合使用两种荧光基团和抗性标记（如 GFP:Blast 和 RFP:Puro），您可以进行双重富集以分离包含每个构建体之一的细胞，因此每个等位基因中有一个 KO 盒
TrueTag Stem 试剂盒包括一个 CMV 启动子，用于驱动抗生素抗性标记的表达，不依赖于内源基因启动子。通过这种方式，可以立即进行富集，并且只有在表达感兴趣的蛋白质时才会诱导荧光团的表达。
可使用 Cre/Lox 系统删除所有 TrueTag 构建体中的抗性标记。
通常建议使用 C 端来防止对天然蛋白翻译的干扰。使用 TrueTag Stem 试剂盒时，只能选择标记 C 端。
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仅供科研使用，不可用于诊断目的。