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CRISPR-Cas9 的向导 RNA |
适用于 CRISPR-Cas9 和筛选应用的高质量 gRNAs
使用 CRISPR-Cas9 系统敲除基因表达或敲入特定突变时，高质量的向导 RNAs (gRNAs) 的设计、产生和递送是成功的关键。无论您是需要与 Truecut Cas9 蛋白质 结合使用的即用型转染 gRNAs，还是需要利用慢病毒将编辑工具递送至难转染的细胞或原代细胞，我们都能够为您提供相关产品。使用我们的 gRNA 基因搜索工具找到其中任何一种形式的预设计 gRNAs，或者继续通过下面的选择指南获取其他选择。
对于功能基因组筛选，我们还将先进的 gRNA 设计整合到 CRISPR 文库中，以进行高通量的阵列筛选或经济实惠的混合筛选。
从多个 CRISPR gRNA 形式中选择
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不同 CRISPR gRNA 形式的选择指南
 TrueGuide 合成 gRNA |  LentiArray 慢病毒 gRNA |  精确 gRNA 合成试剂盒 | |
| 概述 |
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| 产品规格 | 合成 RNA 寡核苷酸，经过化学修饰以保持稳定性 | 慢病毒颗粒 | 体外转录 (IVT) gRNA |
| 应用 | 敲除（预设计）或敲入（定制） | 敲除，包括文库筛选 | 敲除或敲入 |
| 物种 |
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| 递送方式 | 脂质体介导的转染或电穿孔转染 | 慢病毒转导 | 脂质体介导的转染或电穿孔转染 |
| 推荐的 Cas9 形式 | TrueCut Cas9 蛋白家族 | LentiArray Cas9 慢病毒 | TrueCut Cas9 蛋白家族 |
| 对照 | 可用的阳性和阴性对照 | 可用的阳性和阴性对照 | |
| 立刻订购 | 立刻订购 | 立刻订购 |
搜索和订购 gRNA 的快速工具
搜索预设计合成或慢病毒 CRISPR gRNA
TrueGuide 合成 gRNA 是即用型转染 CRISPR 单链向导 RNA (sgRNAs)，旨在为您所需的靶基因提供特异性和高效的敲除。如果您需要富集编辑的细胞、处理难转染的细胞或需要长期表达 sgRNA，请使用我们的 LentiArray CRISPR gRNAs。
订购定制合成 gRNA
您有自己的设计吗？无论是来自期刊文章或同事，还是您最喜欢的设计工具，均可通过我们简单快速的界面上传您想合成的定制 gRNA 序列至定制 TrueGuide gRNA。
使用我们的设计工具创建基因编辑实验和订购您所需的 gRNAs
需要设计方面的帮助来构建工程改造细胞系？您可以使用我们的免费 TrueDesign Genome Editor 软件设计您的 CRISPR 基因敲除、敲入或标记实验，和订购一整套所需的试剂（包括 gRNAs）。
如需板形式或其他特殊订购形式的向导 RNAs，请联系我们
如需订购超过 24 个 gRNAs 以在 96 孔板上进行递送，或与其他核酸酶或特定支架序列结合使用的 gRNA，请通过 GEMservices@thermofisher.com 联系我们。
适用于 CRISPR 的 TrueGuide 合成 gRNA
Invitrogen TrueGuide 合成 gRNAs 是一种即用型转染 CRISPR 向导 RNAs，采用专有算法设计，可实现高效编辑。这些预设计的、可靠的单向导 RNAs 可提供靶向敲除，在人和小鼠基因组有高特异性。
TrueGuide 一段修饰的合成 gRNA | |
| 小鼠和人细胞的预设计基因敲除 | |
| 定制序列 | |
| 提供经验证的对照品 | |
| 板形式 | |
| 即用型转染 | |
| 化学修饰* | |
| 原代细胞和干细胞的理想选择 |
*化学修饰包括 2´O-甲基类似物和硫代磷酸酯键，以提高编辑效率，防止核酸酶降解。
数据：使用 TrueGuide 合成 gRNAs 进行高效编辑
图 1.在表达 Cas9 的 ME-180 细胞中使用 TrueGuide 合成 gRNAs 稳健切割激酶基因。平均切割效率为> 60%。
数据：TrueGuide 合成 gRNAs 有助于维持细胞活力
图 2.TrueGuide 合成 gRNAs 与优化实验方案一起使用，可降低细胞毒性。使用我们推荐转染方案，采用 Lipofectamine CRISPRMAX 形成复合物，并将 TrueCut Cas9 蛋白 v2 和靶向特异性 TrueGuide 合成 gRNA 递送至两种癌细胞系中。在这 3 个基因位点中，已知有 2 个（PRKCG-T1 和 CMPK1-T1）难以编辑。使用 PrestoBlue 检测细胞活力。数据显示转染导致的毒性极低，总体细胞活力保持在接近 100% 的水平。
TrueGuide 合成向导 RNAs — 常见问题 (FAQs)
gRNA （或称向导 RNA）是 CRISPR-Cas9 系统的一部分。gRNA 分子有两个组分：一个靶点特异性 CRISPR RNA (crRNA) 和一个辅助性的反式激活 crRNA (tracrRNA)。gRNA 通过 20-mer crRNA 序列与靶基因组序列之间的碱基配对，将 Cas9 蛋白导入特异性基因位点。
sgRNA 代表单向导 RNA，与传统的天然化脓性链球菌 CRISPR-Cas9 系统不同，其使用两部分向导，其中 CRISPR RNA (crRNA) 与 tracrRNA 杂交。sgRNA 将两个 RNA 结合成单个长 RNA。sgRNA 的长度通常为 100 nt，可以从载体表达或化学合成。
由于与双部分 gRNA相比，修饰的 sgRNA 在更多类型的细胞中表现出更高的效率，因此 TrueGuide crRNA:tracrRNA 两部分向导 RNA 产品形式已停用。这使得我们能够简化我们的合成 gRNA 产品，并专注于修饰的 sgRNA。
CRISPR gRNA 可以从赛默飞世尔科技获得，有以下两种形式可供选择：化学合成的 RNA 寡核苷酸、包装的慢病毒颗粒或使用 GeneArt 精确 gRNA 合成试剂盒生成的体外转录 (IVT) gRNA。
化学修饰包括分子 5' 和 3' 末端的 2' O-甲基类似物和硫代磷酸酯核苷酸间键。这些修饰分别通过增强与靶位点的结合并抑制核酸酶降解提高编辑效率。
您可以使用定制 gRNA 订购工具购买未进行任何化学修饰的 sgRNA。
用 TrueCut Cas9 蛋白质转染时，TrueGuide 合成 gRNA 在广泛的细胞类型中有更高的编辑效率，同时降低了细胞毒性和先天性免疫反应。与质粒系统不同，RNP 系统是瞬时系统，转化较快，可降低随机整合和脱靶效应。
采用质谱法分析 TrueGuide 合成 gRNA 序列，以验证序列完整性。
为了估计混合细胞群中 CRISPR/Cas9 介导的编辑效率，您可以使用 GeneArt 基因组切割检测试剂盒、新一代测序 (NGS) 或 Sanger 测序。无论是对编辑群中扩增子的 NGS 测序还是对克隆到质粒中的扩增子的 Sanger 测序，均可更准确地估计编辑效率和插入缺失类型的百分比。这些方法的更广泛的讨论请参阅 TALEN 和 CRISPR 验证工具页面，实验方案指导请参阅 TrueGuide 合成 gRNA 用户指南。
适用于筛选和编辑难转染细胞系的LentiArray 慢病毒 gRNA
Invitrogen LentiArray CRISPR gRNA 是经过预设计的预包装 gRNA 慢病毒，专门用于高效基因敲除。LentiArray CRISPR gRNA 设计使用专有 gRNA 设计算法创建，且经过优化，可实现高效基因敲除，同时不会影响特异性。
使用 LentiArray CRISPR 文库进行高通量筛选实验时，可以使用 LentiArray CRISPR gRNA 支持筛选前检测方法开发和筛选后结果验证。应将 LentiArray CRISPR gRNA 与 LentiArray Cas9 慢病毒结合使用，以进行难转染细胞系和原代细胞的基因组编辑实验。
数据：使用 LentiArray gRNA 成功敲除 EGFP
图 3.使用 LentiArray gRNA 进行 CRISPR-Cas9 介导的 EGFP 敲除。(A) 用 LentiArray Cas9 慢病毒和 LentiArray CRISPR gRNA 对 A431 细胞进行 EGFR 敲除（右列），并与未经处理细胞（野生型，左列）和用 Cas9 处理但未经 gRNA 处理的细胞（Cas9 对照，中间列）进行对比。对细胞进行 EGFR 表达（绿色）、细胞核（蓝色）和细胞骨架肌动蛋白 Actin（红色）染色，并进行免疫荧光分析。仅在 EGFR 敲除细胞（c、f）中观察到 EGFR 表达缺失。(B) 还通过免疫印迹观察到 EGFR 敲除细胞的 EGFR 信号相对于对照减少。
适用于快速生成定制设计的 IVT gRNA
GeneArt 精确 gRNA 合成试剂盒是快速合成向导 RNA (gRNA) 的完整系统。
使用该试剂盒，以两个编码靶序列的短单链寡核苷酸为起始材料，将这些寡核苷酸和 T7 启动子进行一次较短的“一锅”PCR 反应，组装生成 gRNA 模板。随后，组装产物用作体外转录 (IVT) 反应的模板。后续快速纯化步骤会在短短 4 小时内产生高产量 (>10 μg)、高浓度 (>200 ng/μL)和可直接转染的 gRNA。
IVT gRNA 与我们的 TrueCut Cas9 蛋白 v2 已经在多种悬浮和贴壁细胞系中进行测试，具有 >70% 的切割效率且无毒性迹象。
所得 gRNA 也可以与我们的即用型转染 CRISPR 核酸酶 mRNA 进行共转染。蛋白质和 mRNA Cas9 两种形式均无需进行质粒操作，并且与高通量和多重全基因组细胞工程方法相容。
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