NEXT Online Magazine : フローサイトメーターにおける細胞増殖測定を新しいステージで

Click-iT® Plus EdUで簡単便利なマルチパラメーター測定

金井拓哉（ライフテクノロジーズジャパン株式会社　テクニカルサポート）

［要旨］
Jurkat細胞を用い、新しい細胞増殖測定キットClick-iT® Plus EdUと従来のClick-iT® EdUを比較しました。その結果、新しいキットは従来品と同等以上に新生DNAを検出し、優れた多重染色が行えました。また操作ステップに要する時間は、従来品と変わらず、トータル1～2時間ほどで済みましたが、Attune®Acoustic Focusing Cytometerでデータを比較したところ、新しいキットは従来品よりも解像度が高いことがわかりました。Click-iT® Plusシリーズは従来よりも穏やかな条件下でクリック反応を行うので、これまでは難しかったGFPやPEなどの蛍光タンパク質とも併用できます。

［背景］
これまで細胞増殖測定（S期細胞の同定）には、核酸誘導体としてBrdUを使用するケースが一般的でしたが、DNAに取り込まれたBrdUの検出には抗体を使用するため、事前に厳しい条件下でDNAを変性ステップする必要がありました。これに対して、EdUという核酸誘導体を使うと、検出はマイルドなクリック反応を介して低分子化合物で行うので、変性ステップは不要です（下図参照）。高次構造を保持したままで検出できるので、組織染色にも適しています。

▶BrdU法とクリック反応を用いたEdU法の比較

BrdU法は抗体で検出するので、サンプルを塩酸や加熱処理する必要があり、操作が煩雑でデータ解像度も低いという問題点がありました。クリックケミストリに基づくEdU法は、DNA鎖に取り込まれたチミジンアナログのEdUに蛍光色素を特異標識するので、煩雑な処理も必要なく、高解像度のデータを取得できます。

［使用キット］

Click-iT® Plus EdU Alexa Fluor® 488 Flow Cytometry Assay Kit（NEW・新製品、製品番号C10632 ）
Click-iT® EdU Alexa Fluor® 488 Flow Cytometry Assay Kit（Classic・従来品、製品番号C10425 ）［細胞およびEdUの取り込み］
Jurkat細胞へEdUをfinal10μMで添加し、37℃5%CO2 環境下で90分インキュベーション

［実験操作］

操作は全て製品プロトコルに準じて実施
固定処理前にPE標識抗CD3抗体（製品番号MHCD0304）で表面抗原を検出
細胞周期解析にはFxCycle™ Violet Stain（製品番号F10347）を使用
データはすべてAttune® Acoustic Focusing Cytometer（Violet/ Blue laser type）で測定

Click-iT Plus EdU （New） & Click-iT EdU （Classic）	Time
細胞へEdUを添加	1～2hour
細胞を回収	5min
細胞表面抗原の検出（必要に応じて）	15～30min
Click-iT® Fixativeで細胞を固定処理	15min
Click-iT® permeabilization bufferで細胞膜を透過処理	15min
Click-iT® 検出反応※	30min
細胞内・表面抗原の検出（必要に応じて）	15～30min
細胞周期解析用蛍光試薬での染色（必要に応じて）	15～30min
Total	3～4.5hour

各ステップ間に洗浄操作が必要です。※Click-iT® 検出反応用カクテルの調製ステップも同じです。
（混合する試薬の種類は異なりますが、量は変わりません）

［結果と考察］
Jurkat細胞へ実験方法の通りにEdUを取り込ませて回収後、 PE標識抗CD3抗体で表面抗原を標識しました。次にClick-iT® Fixativeで細胞を固定後、ClickiT® permeabilization bufferで細胞膜を透過処理し、それぞれのEdUキットでクリック反応を行いました。さらに細胞周期解析試薬FxCycle™ Violet Stainで細胞内のすべてのDNAを染色し、Attune® AcousticFocusing Cytometer（Violet / Blue laser type）で測定しました（図1 ）。細胞周期解析用の蛍光試薬FxCycle™ Violet Stain のシグナルは、細胞のDNA含量に比例するので、細胞周期のどのステージに細胞がいるかを示します（図2参照）。図1の結果より、 ClickiT® Plus EdU（緑色）はClick-iT® EdU （紫色）に比べてシグナル分離が優れていることがわかりました。次に2 つのE d UキットのE d U – AlexaFlour®488azide由来のシグナルに対する細胞数をカウントしたところ（図3）、Click-iT® Plus EdUでは46%、Click-iT® EdUでは36%となり、新生DNA合成が行われた細胞集団（S期細胞集団）の割合は36～46%という結果が得られました。最後に、PE標識抗CD3抗体で細胞表面のCD3を検出した結果を図4に示します。ClickiT® Plus EdUではClick反応前にPE標識抗体を添加してもデータに影響せず、多重染色が行えることが示されました。これによりClick-iT® PlusはPE標識抗体とも併用できることがわかりました。

なおフローサイトメトリー用Click-iT® Plus EdU キットにはAlexa Fluor 488以外にも、レッドレーザー励起のAlexa Fluor 647やバイオレットレーザー励起のPacific Blueがあり、GFPやPEなどの蛍光色素と柔軟に組合わせて様々なアプリケーションに使えます。

図1. EdUとFxCycle Violetのマルチプレックス解析
X軸は細胞周期ステージ、Y軸は新生DNA合成量を示します。データの組み合わせから、G1/G0期、S期、G2/M期の細胞を同定できます。FxCycle™ Violet Stain のシグナルは、細胞あたりのDNA含量を反映しています（図2参照）。緑はClick-iT® Plus EdU、紫はClick-iT® EdU。